Biologie cellulaire

Acheminement des protéines à travers le réticulum endoplasmique et le Golgi

 

Cette ressource a été réalisée par IJsbrand Kramer et Gérard Tramu, Professeurs de l'Université Bordeaux 1. Elle a bénéficié de la participation active de :

Dans cette ressource nous nous focaliserons sur les processus de maturation et de tri des protéines synthétisées sur des ribosomes associés à la membrane du réticulum endoplasmique, processus qui permettent de comprendre comment les protéines transitent par le RE et le Golgi vers leurs sites spécifiques de destination. Nous verrons que c'est la nature de la protéine elle-même qui détermine sa destination grâce à la présence de séquences peptidiques spécifiques (étiquettes), de longueur variable (3 à 30 acides aminés). Dans un cas particulier, l'étiquette est un glucide phosphaté. Ces séquences ou ce glucide, sont reconnus par des récepteurs spécifiques qui dirigent leur charge vers le compartiment cellulaire suivant. Le transport entre les compartiments est assuré par des vésicules membranaires, ce qui implique un très actif processus de fission suivi de fusion. Enfin, nous montrerons comment les multiples voies d'exocytose et endocytose sont à la base d'un intense trafic entre le pôle trans-golgien, les lysosomes et la membrane plasmique.

Prérequis  :

Objectifs  :

Temps de travail prévu  :  6 heures

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Sommaire :

:: Introduction
Acheminement vers le réticulum endoplasmique (REr)
    :: Deux catégories de protéines déterminées par la présence ou l'absence du peptide signal
    :: Le peptide signal induit le passage vers le REr : acheminement co-traductionnel
    :: Quelles protéines entrent dans le REr ?
Le passage par le RErugueux : modification co-traductionnelle et repliement des protéines
    :: Les protéines chaperonnes : leur rôle dans le repliement
    :: Oligomérisation
    :: La glycosylation
    :: Les ponts disulfure
    :: Ancrage lipidique GPI
    :: Contrôle qualité dans le REr
Le passage du REr au réseau trans-golgien : les principes du transport vésiculaire
    :: Présentation de l'appareil de Golgi
    :: Transport vésiculaire en partance du REr et transitant par l'appareil de Golgi
    :: Phase 1. Sélection de la charge, formation du manteau et bourgeonnement : un processus trois-en-un initié par des petites GTPases
    :: Phase 2. Fission et fusion des vésicules de transport
    :: Phase 3. Démantèlement du complexe SNARE par NSF et alpha–SNAP
Un premier transit : du REr au Golgi par l'intermédiaire du compartiment ERGIC
    :: Introduction
    :: Première GTPase : Sar1 et son rôle dans le recrutement des protéines du manteau et de la charge
    :: Deuxième GTPase : Rab1 et son rôle dans le recrutement des protéines accessoires de fusion
    :: Troisième GTPase : Arf1 et son rôle dans la transformation du compartiment ERGIC en citerne cis-golgienne
Un deuxième transit : passage au travers du Golgi
    :: Passage de la charge au travers du Golgi : transport antérograde
    :: Passage de la charge au travers du Golgi : transport rétrograde par des vésicules COPI
La glycosylation dans le Golgi
    :: Enzymes impliquées
    :: Elaboration de glycoprotéines et de protéoglycanes
    :: Une modification spécifique : la formation de mannose–6–phosphate, « glucide de destination » des enzymes lysosomiques
Troisième transit : tri vers les différents compartiments, lysosome primaire et vésicule de sécrétion
    :: Vers le lysosome primaire grâce au récepteur du mannose–6–phosphate (exemple de la pro-cathepsine L)
    :: Recyclage des récepteurs MPR
    :: Le point sur les endosomes (précoces et tardifs) et les lysosomes (primaires et secondaires)
    :: Vers la voie de sécrétion constitutive
    Vers la voie de la sécrétion contrôlée
        :: Sécrétion d'insuline
        :: Libération de neurotransmetteurs
Les voies d'endocytose
    :: Cavéoles
    :: Vésicules tapissées de clathrine
    :: Phagocytose
Les endosomes
    :: Endosome précoce
    :: Endosome tardif


Introduction

Dans une ressource précédente, nous avons vu comment les protéines sont synthétisées sur les ribosomes. Les nouvelles protéines doivent rejoindre des sites très divers de la cellule (et de son environnement). Un système de tri et d'acheminement est donc nécessaire pour assurer que ces nouvelles protéines gagnent bien leur destination. Dans la ressource intitulée « Transport membranaire », nous avons déjà souligné que certains organites, comprenant le réticulum endoplasmique, l'appareil de Golgi, les endosomes, les lysosomes et les vésicules sécrétoires, communiquent entre eux, mais aussi avec l'extérieur de la cellule (par la voie d'endocytose et d'exocytose). Leur contenu peut donc être assimilé au milieu extracellulaire (voir figure 1). Ainsi, lors du processus de protéosynthèse, un premier tri crucial a lieu, déterminant quelles protéines doivent traverser la membrane au niveau du réticulum endoplasmique rugueux (par le canal de translocation) et prendre ainsi « la voie extracellulaire » et quelles protéines doivent rester dans le cytoplasme. Un deuxième tri va ensuite déterminer la destination plus précise des protéines pour les aiguiller vers un organite ou un compartiment cellulaire donné.

Figure 1. Deux compartiments cellulaires

Figure 1. Deux compartiments cellulaires

Dans cette ressource, nous expliquerons comment les protéines gagnent le réticulum endoplasmique, le Golgi, le lysosome ou les vésicules de sécrétion (puis la membrane plasmique). La façon dont les protéines gagnent les autres organites sera traitée dans une ressource ultérieure, sur l'« acheminement des protéines vers le peroxysome, la mitochondrie ou le noyau ».

Sommaire


Acheminement vers le réticulum endoplasmique (REr)

 

Sommaire


Acheminement vers le réticulum endoplasmique (REr)
Deux catégories de protéines déterminées par la présence ou l'absence du peptide signal

Dans un but didactique, on séparera donc arbitrairement les protéines synthétisées en deux catégories :

  1. des protéines destinées au cytosol et aux organites strictement intracellulaires comme la mitochondrie, le noyau et le peroxysome,

  2. des protéines destinées aux membranes et lumières du REr, du Golgi, du lysosome et des vésicules de sécrétion.

Figure 2. Ribosomes libres ou liés au RE

Figure 2. Ribosomes libres ou liés au RE

C'est la nature de la protéine elle-même qui détermine sa destination grâce à la présence de séquences peptidiques spécifiques (étiquettes), de longueur variable (3 à 30 acides aminés).

Un premier étiquetage porte sur l'éventuelle présence d'une séquence linéaire hydrophobe N–terminale qui servira à l'ancrage sur le réticulum endoplasmique rugueux (REr) et qui rangera la protéine en synthèse dans la catégorie 2 (voir figure 2). Les protéines qui ne portent pas cette séquence appartiennent toutes à la catégorie 1. Cette étiquette N–terminale, responsable d'un tri qualifié de co-traductionnel, est nommée « peptide signal » (signal peptide ou SignalP).

  

La base de données SignalP permet de prédire l'existence d'un peptide signal dans une séquence amino-acidique d'une protéine quelconque. Pour en savoir plus, consultez le site web : http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/

Un second étiquetage, porte sur l'éventuelle présence d'autres séquences (non obligatoirement N–terminales, hydrophobes ou linéaires) qui serviront à déterminer, de plus en plus précisément, la place de la protéine en cours d'acheminement vers son site définitif. Cette étiquette responsable d'un tri qualifié de post-traductionnel, est nommée « peptide de destination » (target peptide ou TargetP).

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Acheminement vers le réticulum endoplasmique (REr)
Le peptide signal induit le passage vers le REr : acheminement co-traductionnel

Le premier tri est réalisé par un récepteur qui reconnaît le peptide signal. On le qualifie de « particule de reconnaissance du signal » (SRP), composée de protéines (six chaînes polypeptidiques, chacune nommée d'après sa masse moléculaire ; SRP 9, 14, 19, 54, 68, 72), d'ARN (ARN 7S de 300 nucléotides) et de GTP. Cette particule se fixe à la fois au peptide signal (liaison récepteur-ligand) et au ribosome duquel le peptide signal émerge (voir figure 3 et cliquez sur les loupes pour plus de détails). L'ensemble SRP / ribosome est ensuite recruté sur la surface du réticulum endoplasmique par un récepteur membranaire, le récepteur du SRP, lui-même lié au canal de translocation (PCC). Au cours de cet événement la synthèse de la protéine est suspendue car le SRP bloque l'accès des facteurs d'élongation, eEF–1 et eEF–2 (et ceci évite que la protéine destinée au REr ne soit libérée dans le cytoplasme). Ce recrutement est suivi par une hydrolyse du GTP, en GDP et Pi, qui libère la particule SRP.

Figure 3. Le peptide signal, son récepteur SRP et la translocation vers le REr

Figure 3. Le peptide signal, son récepteur SRP et la translocation vers le REr
[Cliquez sur les 2 loupes pour plus de détail...]

Le canal de translocation, constitué de plusieurs protéines dont le Sec61p, fixe ensuite le « peptide signal ». La protéine naissante, au fur et à mesure de sa croissance, empruntera le canal pour passer entièrement dans la lumière du réticulum (protéine sécrétée) ou pour progressivement être intégrée à la membrane (protéine transmembranaire) (voir figure 4). La nature hydrophobe du peptide signal (hélice–) permet également une interaction avec les phospholipides de la membrane.

Figure 4. Le canal de translocation du REr

Figure 4. Le canal de translocation du REr
[Cliquez sur la loupe pour plus de détail...]

Pendant la translocation, le canal (qui forme un pore d'environ 4 nm de diamètre) ne laisse pas passer les solutés. Après la translocation, le canal se ferme (cliquez sur la loupe de la figure 4 pour plus de détails structuraux du canal de translocation). Lors de la synthèse de protéines sécrétoires, les protéines destinées à la lumière du REr, du Golgi ou du lysosome, le peptide signal est excisé par une peptidase liée au canal de translocation (voir figure 5 et cliquez sur les loupes pour des exemples précis qui concernent l'insuline, le récepteur de l'EGF et la rhodopsine). Pour les protéines transmembranaire, deux options se présentent : les protéines transmembranaires dont le C–terminal est intracellulaire et le N–terminal extracellulaire perdent leur peptide signal. Pour les autres, le peptide signal est préservé et persiste sous forme d'hélice– comme site d'insertion dans la membrane (revoir le cours à ce sujet)

L'entrée de la chaîne polypeptidique dans le REr ne se fait que lorsqu'elle compte au moins 70 acides aminés (40 se trouvant encore dans le ribosome et 30 transitant par le canal de translocation).

Figure 5. Différents passages membranaires dans le REr

Figure 5. Différents passages membranaires dans le REr
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Pour en savoir plus, consultez le document suivant : « protein conducting channel » (502 Ko), Bert Van Den Berg

  

L'hypothèse du « signal »

Elle a été énoncée en 1971 par Günter Blobel (Laboratory of Cell Biology, Rockefeller University, New York) qui s'interrogeait sur la façon dont les protéines destinées à sortir de la cellule étaient d'abord dirigées vers le réticulum endoplasmique. Il s'appuyait sur les travaux de biochimie et microscopie électronique, effectués par le groupe de George Palade (dans le même laboratoire), qui avaient montré en détail comment les protéines nouvellement synthétisées traversent successivement le réticulum endoplasmique rugueux et le Golgi pour arriver dans les vésicules de sécrétion, les lysosomes ou la membrane cytoplasmique. Blobel a démontré que ces protéines portaient un signal intrinsèque qui leur permettait d'atteindre la membrane du réticulum et de la traverser : c'est l'hypothèse du signal. Le mécanisme est universel car il fut retrouvé aussi bien chez la levure, que chez les végétaux et les animaux. Pour ses travaux, Blobel a été récompensé en 1999 par le prix Nobel de Physiologie et Médecine.

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Acheminement vers le réticulum endoplasmique (REr)
Quelles protéines entrent dans le REr ?

Un tiers environ des protéines totales de la cellule transite par le REr. Plusieurs exemples sont déjà évoqués dans les ressources précédentes :

Les autres protéines, non encore évoquées dans les ressources précédentes, sont :

  

Utilisation du terme « lumière » pour désigner l'intérieur des structures creuses de diamètres variés (de quelques nm à quelques cm)

Après coloration, une coupe histologique examinée au microscope révèle :

  1. des zones pleines occupées par des tissus diversement teintés et

  2. des zones optiquement vides qui laissent librement passer la lumière (du système optique) et qui représentent l'intérieur de structures cavitaires et tubulaires.

Et donc, très tôt, les observateurs ont pris l'habitude de désigner par lumière la cavité interne libre des structures et organes creux (tube digestif, vaisseaux sanguins, glandes et canaux glandulaires etc.) Plus tard, par analogie, la microscopie électronique a utilisé le même terme de « lumière » pour désigner, à l'échelon cellulaire cette fois-ci, les cavités apparemment vides ou très peu denses aux électrons, délimitées par une membrane unitaire (citernes du REr et du Golgi par exemple).

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Le passage par le RErugueux : modification co-traductionnelle et repliement des protéines

Dans la lumière du REr de nombreuses protéines prennent en compte les modifications et le repliement de protéines néo synthétisées. Elles font partie d'un grand complexe qui entoure la chaîne de la protéine naissante dès qu'elle pénètre dans le REr (voir tableau ci-dessous). Le nombre de ces protéines dépasse celui des protéines naissantes si bien que d'éventuels agrégats néfastes à la vie de la cellule sont évités. Dans les paragraphes suivants, nous présenterons les différents aspects du repliement des protéines sous forme d'une séquence apparemment chronologique, en étant cependant conscient que la plupart des processus décrits peuvent se dérouler simultanément (et dans un même site).

Tableau 1 : interactions actuellement connues entre BiP (Grp78) et les protéines impliquées dans le repliement et les modifications post-traductionnelles des protéines naissantes.

Protéine liée à la BiP :

appartient à la famille de :

Protéine naissante

 

Grp94

Hsp90

calréticuline

lectine

UGGT

lectine

ERdj3

Co–chaperonne

PDI

thirédoxine oxydoréductase

ERp72

thirédoxine oxydoréductase

CaBP1

thirédoxine oxydoréductase

Erp29

thirédoxine oxydoréductase

Cyclophiline

peptidyl–prolyl cis–trans isomérase

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Le passage par le RErugueux : modification co-traductionnelle et repliement des protéines
Les protéines chaperonnes : leur rôle dans le repliement

Le REr contient de nombreuses protéines chaperonnes qui sont capables de reconnaître des domaines de protéines naissantes dans leur état provisoire et d'assurer leur repliement approprié. Parmi elles, la plus abondante protéine du REr, est la BiP (binding protein) aussi appelée Grp78 (glucose regulated protein–78) un orthologue de la Hsp70 cytosolique. L'appellation « binding protein » vient du fait que, lors de son identification, cette protéine était systématiquement liée à la chaîne lourde des immunoglobulines (Ig) produites par le lymphocyte B. Dans le REr on trouve également la Grp94, orthologue de la Hsp90 cytosolique (voir figure 6).

Figure 6. Fixation de chaperonnes et glycosylation des protéines naissantes

Figure 6. Fixation de chaperonnes et glycosylation des protéines naissantes
[Cliquez sur les loupes pour plus de détail...]

L'interaction d'une chaperonne avec sa protéine cliente est étroitement dépendante de l'ATP dont l'hydrolyse (en ADP et Pi) assure un cycle d'évènements d'association et de dissociation des deux protéines (cliquez sur la loupe de la figure 6 pour plus de détail). Le cycle est régulé par des protéines accessoires qui sont des facteurs qui catalysent l'hydrolyse (« ATPase activating factor » tels que ERdj3) et des facteurs qui catalysent l'échange d'ADP par ATP (Adenine exchange factor tels que Bag–1).

  

Chaperonnes en série

Il est possible que les chaperonnes agissent en série : d'abord Grp78 qui a une forte affinité pour des segments hydrophobes (7-8 acides aminés) dans les protéines non pliées, puis Grp94, qui interagit avec la protéine partiellement pliée, vraisemblablement par l'intermédiaire d'un doigt amphiphatique qui s'insère dans une fente ou crevasse de la protéine cliente (voir figure 07 deuxième plan, et cliquez sur la loupe positionnée sur Grp94).

Un autre groupe abondant est représenté par des chaperonnes qui possèdent un domaine lectine se liant donc spécifiquement à certains résidus glucidiques (glucose ou mannose pour le REr). La calréticuline est une lectine chaperonne soluble alors que la calnexine est une protéine transmembranaire (cliquez sur la loupe de figure 6 pour plus de détail). Ces deux lectines chaperonnes n'ont pas d'équivalents dans d'autres compartiments cellulaires. Leur rôle dans le repliement est évoqué ci-dessous (« la glycosylation »).

  Partez en excursion : découverte des chaperonnes

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Le passage par le RErugueux : modification co-traductionnelle et repliement des protéines
Oligomérisation

Certaines protéines s'assemblent pour former de très larges complexes fonctionnels. Un bon exemple est donné par le récepteur nicotinique à l'acétylcholine (canal ) et un autre par le CMH class I. Tous deux sont assemblés dans le REr mais sans que l'on connaisse les modalités exactes de l'assemblage.

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Le passage par le RErugueux : modification co-traductionnelle et repliement des protéines
La glycosylation

Spécifique du REr est l'addition cotraductionnelle d'un oligosaccharide aux protéines membranaires et sécrétoires. Cette addition, appelée N–glycosylation, se fait sur le groupement d'un résidu asparagine dans le contexte –N–X–S/T– (où X réprésente n'importe quel acide aminé excepté la proline pour des raisons d'encombrement stérique). L'oligosaccharide, appelé cupule glucidique (« core glycan »), est une unité stéréotypée de 14 résidus glucidiques comprenant : 2 acétylglucosamines, 3 glucoses et 9 mannoses.

Dans un premier temps, la cupule est assemblée côté cytoplasmique sur un long lipide du type dolichol–pyrophosphate ancré dans la membrane du REr. Dans un second temps, la cupule est transférée en bloc vers l'intérieur du REr et se lie à une asparagine de la chaîne polypeptidique (émergeant du canal de translocation), au cours d'une réaction catalysée par l'oligosaccharyltransférase (grand complexe enzymatique membranaire). Deux glucoses, en position 2 et 3, sont immédiatement enlevés par une glucosidase–2 et –1 respectivement (voir figure 06). La protéine maintenant monoglucosylée (il reste encore un glucose en position 1) est reconnue par une lectine chaperonne, la calnexine (ou la calréticuline) qui favorise son repliement (voir ci-dessus).

Après un laps de temps, durant lequel la protéine a atteint un certain degré de repliement, le glucose restant est éliminé (par la glucosidase–2). La protéine cliente se sépare de la lectine chaperonne. Si elle n'est pas dans son état de repliement définitif (« native fold ») elle est reconnue par UGGT (une glucosyltransférase, voir ci-dessous), reglucosylée en position 1 et de nouveau fixée par la lectine–chaperonne calnexine (ou calréticuline). Ce cycle peut se répéter plusieurs fois et se termine soit par la destruction de la protéine soit par son passage vers le Golgi (voir figure 07).

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Le passage par le RErugueux : modification co-traductionnelle et repliement des protéines
Les ponts disulfure

Contrairement au cytosol le RE constitue un environnement oxydant capable d'arracher des électrons (et aussi par conséquent, des protons) à la protéine nouvellement synthétisée. Un tel environnement favorise la formation de ponts disulfures entre les cystéines dans la réaction suivante :

Les ponts disulfures ont la propriété de stabiliser la protéine en réduisant son entropie configurationnelle dans l'état non replié. Plus tard, selon l'environnement, leur mise en place ou leur coupure va établir un contrôle, qualifié de contrôle rédox, de l'activité de la protéine.

Figure 7. Mise en place de ponts disulfures et vérification de la qualité de repliement

Figure 7. Mise en place de ponts disulfures et vérification de la qualité de repliement

La réaction d'oxydation est rendue possible par la présence de FAD (flavine adénine dinucléotide), accepteur d'électrons (et de protons) du RE. Le principe général veut que les électrons d'une structure moléculaire possédant un bas potentiel rédox vont vers une structure possédant un haut potentiel rédox (voir aussi : potentiels d'oxydoréduction des composants de la chaîne respiratoire). Les différentes protéines impliquées dans la formation de ponts disulfures possèdent toutes le pli de « thirédoxine » (domaine Trx) contenant un site catalytique composé de deux cystéines dans un motif –C–X–X–C–. Le potentiel rédox du site catalytique varie selon les protéines qui le portent, ce qui détermine leur place dans la chaîne des événements et leur choix de substrats.

Les évènements de cette chaîne sont les suivants : la protéine cliente interagit avec une disulfure isomérase, soit ERp57 (endoplasmic reticulum protein de 57 kDa) dans le cas de protéines liées aux lectines chaperonnes, soit PDI (protein disulfure isomerase de 59 kDa (aussi connu comme ERp59)) dans le cas de protéines liées à d'autres chaperonnes (telles que BiP ou Grp94). La disulfure isomérase oxyde les groupements SH (dithiol) en arrachant deux électrons et deux protons et crée donc un pont disulfure (voir figure 8). Les électrons et protons arrachés sont transitoirement hébergés par les disulfides (S–S) du site catalytique formant ainsi les dithiols (SH SH). Une deuxième protéine, qualifiée d'oxyréductine, porteuse elle aussi du site catalytique (–C–X–X–C–), oxyde le PDI ou l'ERp57 et transporte les électrons et protons vers le FAD, le convertissant en FADH2. L'oxyréductine de PDI est Ero1–L, celle de l'Erp57 n'a pas encore été identifiée. La séquence peut recommencer lorsque le FADH2 aura cédé ses électrons et protons à l'oxygène, pour donner de l'eau (voir figure 8).

Figure 8. Formation de ponts disulfures ; thiol oxydation.

Figure 8. Formation de ponts disulfures ; thiol oxydation.

Après que les premiers ponts disulfures aient été formés, les disulfures isomérases continuent d'aider la protéine à se plier en favorisant l'échange interne de ponts disulfures (les premiers ponts établis n'étant pas forcément les ponts définitifs de la protéine native). Pendant ces réactions d'isomérisation, la disulfure isomérase est transitoirement liée au substrat par une liaison covalente (S–S).

  

Consultez le site web d'un laboratoire performant sur le sujet :
http://www.bijvoet-center.nl/cpc/labmembers/Ineke

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Le passage par le RErugueux : modification co-traductionnelle et repliement des protéines
Ancrage lipidique GPI

D'autres protéines synthétisées elles dans le REr (certaines molécules d'adhérence (N–CAM), certains récepteurs (Thy–1) et des enzymes qui agissent à l'extérieur de la cellule (acétylcholinestérase ou ecto–5'–nucléotidase)), sont ancrées sur un glycolipide, le glycosylphosphatidyl inositol (GPI). Cette modification a uniquement lieu dans la lumière du réticulum et est donc réservée aux protéines qui s'exposent à l'extérieur de la cellule (voir figure 9 et cliquez sur la loupe pour plus de détails).

Figure 9. Ancre lipidique GPI

Figure 9. Ancre lipidique GPI
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Le passage par le RErugueux : modification co-traductionnelle et repliement des protéines
Contrôle qualité dans le REr

   A) Contrôle des protéines N–glycosylées (glycosylation sur une asparagine)

Les lectines chaperonnes agissent de concert avec a/ l'alpha–glucosidase–2 dont le rôle est de détacher un résidu glucose de la cupule glucidique (« core glycan »), libérant ainsi la protéine cliente et b/ l'UGGT (UDP–glucose : glycoprotein glucosyltransférase), enzyme qui a pour unique rôle de reconnaître à la fois la cupule glucidique (dépourvue de glucose) et des segments amino acidiques hydrophobes de 20-30 résidus, typique des protéines presque définitivement repliées (conformation « native-close » ou « molten globule-like », voir figure 11). L'UGGT est donc appelé pour cela le détecteur de repliement du REr (« folding sensor »). Les protéines imparfaitement repliées sont alors reglucosylées et réassociées à la calnexine (ou à la calréticuline) pour subir de nouveau une série de repliements qui leur confèreront leur état définitif (« native state ») (voir figure 10). La durée de ces processus est de l'ordre de la minute à l'heure. Ce cycle se termine quand une mannosidase type I (à « activité lente ») détache un résidu mannose de la branche médiane de la cupule glucidique : ) évitant ainsi la réassociation avec l'UGGT.

Figure 10. Tri de glycoprotéines dans le REr

Figure 10. Tri de glycoprotéines dans le REr

  

Mannosidase type 1

La mannosidase type 1 du REr est une protéine transmembranaire à N–terminal cytosolique, dépendante du et membre de la famille des glycosylhydrolases (dont il existe 47 membres). Elle a la particularité de posséder une arginine en position 273 dans son site catalytique, ce qui lui confère sa préférence pour le mannose 9 de la branche médiane. En revanche, les mannosidases résidant dans le Golgi ont une leucine en position 273 dans leur site catalytique qui leur permet de couper les mannoses des trois branches de la cupule glucidique.

Les protéines mal repliées et modifiées par la mannosidase–1 (possédant donc maintenant une cupule glucidique de GlcNac2–Man8) sont reconnues par l'EDEM (ER–degradation enhancing –mannosidase–like protein), lectine liée à la calnexine par son domaine transmembranaire (ce qui explique pourquoi elle ne se complexe pas avec la calréticuline qui est une protéine soluble). Par cela, les protéines défectueuses sont destinées à sortir du REr par le canal de translocation (Sec61), ubiquitinées (l'identité de l'ubiquitine ligase n'est pas encore connue) puis détruites par le protéasome dans le cytoplasme (voir figure 10). Environ la moitié des protéines qui transitent par le REr sont détruites par cette voie.

Si la glycoprotéine est bien repliée, elle est reconnue par la lectine ERGIC–53 (aussi nommée « p58 ») et transportée vers le Golgi.

Les différentes étapes (hypothétiques) du repliement d'une protéine naissante et leurs niveaux d'énergie sont illustrées dans la figure 11 (revoir aussi le repliement des protéines de la ressource « Synthèse et dégradation des protéines »).

Figure 11. Profil énergétique d'une protéine en cours de repliement

Figure 11. Profil énergétique d'une protéine en cours de repliement

 

   B) Contrôle des protéines non-glycosylées

Ces protéines sont soumises à un autre contrôle de qualité dont on sait généralement peu de choses. Les chaperonnes les plus abondantes dans le REr, telles que BiP et Grp94, sont supposées intervenir. De plus, quelques exemples ponctuels peuvent être cités : les collagènes interagissent avec la protéine chaperonne Hsp47 ; la lipoprotéine à faible densité (R–LDL) s'associe à RAP (receptor associated protein) puis est dirigée vers le Golgi ; enfin, le complexe majeur d'histocompatibilité classe I (CHM classe I) est retenu dans le REr par la tapasine et le TAP (transporter associated with antigen processing) jusqu'à son association à l'antigène.

  

Pour en savoir plus, consultez les documents suivants : Caramelo UGGT near native folding (237 Ko), et Braakman protein folding (179 Ko).

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Le passage du REr au réseau trans-golgien : les principes du transport vésiculaire

 

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Le passage du REr au réseau trans-golgien : les principes du transport vésiculaire
Présentation de l'appareil de Golgi

Après le REr, de nombreuses protéines sont acheminées vers un autre compartiment cellulaire, l'appareil de Golgi, ainsi nommé car il fut découvert par l'histologiste italien Camillo Golgi qui en publia la première description en 1898.

Figure 12. Structure de l'appareil de Golgi

Figure 12. Structure de l'appareil de Golgi
[Cliquez sur la loupe pour plus de détail...]

L'appareil de Golgi ne contient pas vraiment de membranes ou même de protéines qui lui sont propres ; il représente un point de rencontre transitoire, pour les lipides et protéines en route pour des destinations cellulaires ou extracellulaires multiples. Son existence est le résultat d'une production continuelle de vésicules de transport en provenance du REr, fusionnant en citernes (côté cis-Golgi). Le gain de membrane est compensé par une perte continuelle sous forme de vésicules de transport côté opposé, appelé côté trans. Dans l'ensemble le Golgi se caractérise par des citernes cis (quelquefois réunies sous le nom de réseau cis-golgien), des citernes médianes et des citernes trans (quelquefois réunies sous le nom de réseau trans-golgien) (voir figure 12 et cliquez sur la loupe pour voir le Golgi dans toute sa complexité).

Quelques exemples pour illustrer le transit moléculaire qui caractérise le Golgi : les enzymes impliquées dans la glycosylation des protéines et des lipides, telles que la mannosidase–2 ou la galactosyltransférase, restent associées au Golgi pendant 60 minutes ; les SNAREs et de nombreux récepteurs n'y résident que 10 minutes ; enfin, la plupart des protéines sécrétoires transitent dans les compartiments golgiens en environ 30 minutes.

  Partez en excursion : la découverte de l'appareil de Golgi

  

Pour en savoir plus, consultez les documents suivants : « Golgi review Palade Farquhar » (1078 Ko) et « Camillo Golgi » (279 Ko).

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Le passage du REr au réseau trans-golgien : les principes du transport vésiculaire
Transport vésiculaire en partance du REr et transitant par l'appareil de Golgi

Les protéines ayant été modifiées et repliées, le REr doit faire face à la redoutable tâche de les trier : en retenir le plus grand nombre destiné à s'occuper de la nouvelle vague de protéines synthétisées et diriger les autres vers le Golgi. Les transports de protéines (et de lipides) du REr vers les autres organites (Golgi, lysosome, granules de sécrétion et membrane) se fait par des vésicules, conteneurs limités par une membrane lipidique et dont le contenu est nommé « charge ». Le terme charge désigne aussi bien les protéines (et lipides) destinées aux autres compartiments que les enzymes de modification qui les accompagnent transitoirement. Ce mode de transport est caractérisé par une série d'événements orchestrés par des protéines liant le GTP.

Dans les trois sections suivantes, nous décrirons les grandes lignes des événements moléculaires responsables du transport vésiculaire. Cette description ne se limite pas au passage entre REr et Golgi. Ce sujet est traité plus en détail à partir de la page « Un premier transit : du REr au Golgi par l'intermédaire du compartiment ERGIC ».

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Le passage du REr au réseau trans-golgien : les principes du transport vésiculaire
Phase 1. Sélection de la charge, formation du manteau et bourgeonnement : un processus trois-en-un initié par des petites GTPases

Le tri de la protéine constituant « la charge » implique la liaison de son « peptide de destination » à un récepteur (voir la section « Acheminement vers le réticulum endoplasmique (REr) ») et la concentration du complexe dans un domaine membranaire limité appelé « site de sortie » (« exit site »). Ce site est caractérisé par la formation d'un bourgeon, tapissé du coté cytosolique par une couche protéique complexe hétérogène, appelée manteau (structure bien identifiée en microscopie électronique et dont l'aboutissement est la « coated vesicle » ou « vésicule tapissée »). Les récepteurs de la charge font partie de ce manteau et, avec d'autres protéines, élaborent la charpente de la vésicule en formation. Suivant le site de formation de la vésicule, le manteau est constitué de complexes protéiques spécifiques COP–I (Golgi), COP–II (REr), AP/clathrine (Golgi, endosomes et membrane plasmique), GGA (Golgi) et cavéoline (Golgi/membrane plasmique).

  Partez en excursion : les APs et GGAs sont collectivement
regroupées sous l'appellation « adaptines »

Selon la nature de la charge, deux cas au moins se présentent : 1/ la charge est constituée de protéines transmembranaires (canaux ioniques, récepteurs cellulaires, molécules d'adhérence etc.) dont le peptide de destination cytosolique interagit directement avec le manteau ; 2/ la charge est sous forme de protéines solubles qui se lient d'abord à un récepteur transmembranaire (adaptateur), lui-même lié au manteau par son domaine cytoplasmique. Très peu de données concernent l'identité des déterminants moléculaires tels que les adaptateurs et les séquences amino acidiques des peptides de destination. Bien que la formation de la vésicule tapissée puisse être obtenue expérimentalement in vitro en absence de charge, il est généralement admis que l'interaction entre le manteau et la charge renforce considérablement le processus.

Figure 14. Aménagement du 'site de sortie' par les petites GTPases

Figure 14. Aménagement du « site de sortie » par les petites GTPases

La formation du site de sortie est amorcée par de petites protéines liant le GTP, membres des familles Arf/Sar et Rab. Quand elles se trouvent en position membranaire (coté cytoplasmique) et liées au GTP, elle recrutent sélectivement des récepteurs (composant du manteau), des enzymes modifiant les lipides (phospholipases et PI kinases), des protéines motrices et des golgines (protéines d'arrimage). Ces protéines, à leur tour, recrutent d'autres protéines dont les importantes SNAREs, « protéines de fusion » (voir figure 14).

  

Pour en savoir plus, consultez le document suivant : « COP, clathrin coated vesicle budding McMahon » (418 Ko).

  

Consultez aussi le site web d'un laboratoire performant sur le sujet des petite GTPases :
http://www.curie.fr/recherche/themes/detail_unites.cfm/lang/_fr/id/47.htm

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Le passage du REr au réseau trans-golgien : les principes du transport vésiculaire
Phase 2. Fission et fusion des vésicules de transport

   A) Fission

Les vésicules se détachent du compartiment donneur sous l'action d'une protéine capable de former un anneau qui étrangle progressivement le pédoncule de la vésicule jusqu'à ce que celle-ci se détache : ce processus est appelé « fission ». Dans le cas de fission de vésicules tapissées de clathrine (endocytose), ce rôle est pris par la dynamine, protéine liant le GTP. Cette action qui requiert un fort rayon de courbure de la bicouche lipidique est facilitée par l'action de l'endophiline, enzyme qui convertit l'acide lysophosphatidique (LPA) en acide phosphatidique (PA), deux lipides de conformation conique opposée. Ce mécanisme est bien connu pour ce qui concerne la fission des vésicules issues de la membrane plasmique mais beaucoup moins pour ce qui concerne celles qui proviennent du REr et du Golgi.

Une fois formée, la vésicule perd son manteau sous l'effet de l'hydrolyse du GTP porté par les protéines liant le GTP mais elle conserve la « machinerie protéique de fusion ». L'ensemble est maintenant prêt pour la fusion avec d'autres compartiments cellulaires.

  

Pour en savoir plus, consultez le document suivant : « endophiline Anne Schmidt » (122 Ko).

 

   B) Fusion

La vision actuelle du processus est que les protéines SNARE sont à la base de la fusion des membranes mais que d'autres protéines, qualifiées d'accessoires de fusion, telles que les golgines (les protéines d'arrimage p115, giantine, GM130 etc.), l'ATPase NSF, les SM proteins, rSly et Munc18, ou encore –SNAP, doivent les assister dans leur fonction. Les protéines accessoires doivent leur qualificatif au fait que leur intervention dans la fusion n'est pas encore comprise. Elles sont cependant essentielles car, sans elles, la fusion membranaire testée par expérimentation in vitro, avec les seules SNAREs, met plusieurs heures à se réaliser. L'acronyme SNARE est expliqué dans la boîte ci-dessous.

C'est à propos de l'étude de la synapse et de ses vésicules de neurotransmetteurs que deux familles de SNAREs ont été identifiées. 1/ R–SNAREs, trouvées à l'origine sur les vésicules de neurotransmetteurs et donc initialement appelé v–SNAREs, et 2/ Q–SNAREs, trouvées à l'origine dans la zone présynaptique dense de la membrane plasmique cible (« target ») et donc initialement appelé t–SNAREs. La nomenclature initiale v– et t–SNARE est devenue caduque lorsqu'on a montré qu'une même vésicule du REr ou du Golgi porte les deux types de SNAREs. De plus, au cours du transport vésiculaire entre REr et Golgi, il n'est pas toujours possible de distinguer entre vésicule et cible (donneur et receveur). Les R–SNAREs sont toujours des protéines transmembranaires, alors que les Q–SNAREs sont soit transmembranaires (type II, protéine à N–terminal cytoplasmique et un seul segment transmembranaire) soit membranaires intrinsèques (ancrées par un myristate, SNAP–25). A ce jour, 35 protéines type SNARE ont été identifiées chez les mammifères (et 21 chez la levure).

Figure 15. Les évènements de fusion membranaire par les SNAREs

Figure 15. Les évènements de fusion membranaire par les SNAREs.
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Les acronymes SNARE, SNAP, NSF et sec

Ci-dessous nous précisons la signification des acronymes utilisés dans la dénomination des protéines impliquées dans la fusion : SNARE pour « SNAP receptor » ; SNAP (Sec17) pour « soluble NSF attachment protein » ; NSF (Sec18) pour « n–ethylmaleimide–sensitive factor » ; « sec », dénomination de plusieurs gènes mutés impliqués dans la « sécrétion » chez la levure.

 

  

Neurotoxines et SNAREs

Les neurotoxines clostridiales produites par Clostridium botulinii, agent responsable du botulisme, et par Clostridium tetanii, qui provoque le tétanos, sont de très puissants inhibiteurs de la libération de neurotransmetteurs. L'intoxication des neurones par ces toxines entraîne l'hydrolyse des protéines SNARE, synaptobrévine, syntaxine ou SNAP–25 (selon la toxine). Ces résultats ont été étendus à d'autres types de cellules en introduisant expérimentalement les chaînes légères de ces toxines dans des fibroblastes et cellules épithéliales. L'ensemble de ces résultats a permis de montrer que les protéines SNAREs ont une position clé dans la machinerie de fusion des membranes.

 

  Partez en excursion : la découverte de SNARE, SNAP et NSF

Les R– et Q–SNAREs ont une forte tendance à former des complexes protéiques très stables en s'associant en une structure en câble à quatre brins appelée « bundled coiled-coil ». Cette structure résulte de l'interaction de quatre « motifs SNARE » portés par des hélices amphiphatiques, dont trois proviennent de Q–SNAREs et une de R–SNARE (voir figure 15) Les préfixes R et Q réprésentent respectivement les acides aminés arginine (R) et glutamine (Q). Les R–SNAREs ont une arginine essentielle dans leur motif SNARE, alors que pour les Q–SNARE il s'agira d'une glutamine.

Pour être prêtes à la fusion, les Q–SNAREs doivent être d'abord « activées » pour former un complexe trimérique. Ceci fait, le complexe pourra réagir avec une seule R–SNARE de la membrane opposée (interaction « trans »), l'ensemble formant un bundled coiled-coil appelé SNAREpin, centré par les trois glutamines et l'arginine (voir figure 15, fusion–2). Ces changements de conformation rapprochent les deux membranes et permettent la fusion des bicouches lipidiques. L'établissement d'un complexe stable entre R– et Q–SNAREs constitue la force motrice de la fusion membranaire. Il s'agit d'une force considérable qui doit 1/ chasser l'eau présente entre les deux membranes lipidiques et 2/ déstructurer la bicouche pour former les assemblages lipidiques intermédiaires pendant la fusion (voir figure 15, fusion–3).

Souvent la fusion membranaire de vésicules de sécrétion requiert transitoirement une concentration intracellulaire élevée de (200 nM) dans le but de compléter le cycle des évènements de fusion membranaire. Dans ce cas, on parle d'exocytose « régulée ».

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Le passage du REr au réseau trans-golgien : les principes du transport vésiculaire
Phase 3. Démantèlement du complexe SNARE par NSF et alpha–SNAP

Une fois sa fonction accomplie et pour être recyclé, le complexe SNAREpin doit être démantelé. Ceci est réalisé par une ATPase hexamérique, SNF, associée à trois protéines –SNAP. La réaction est dépendante de l'hydrolyse de l'ATP (voir figure 16, et cliquez sur les loupes pour plus de détail).

Rappelons ici que les Q– et R–SNAREs appartenant à une même membrane peuvent également interagir. Dans ce cas, le complexe formé adopte une conformation « cis » incapable de participer à une fusion. C'est la raison pour laquelle les SNF/–SNAP sont sollicitées en permanence pour dissocier ces complexes cis et maintenir ainsi les potentialités ultérieures de fusion.

Figure 16. Le complexe NSF /alpha–SNAP demantèle le complexe coiled-coil de quatres SNAREs

Figure 16. Le complexe NSF /alpha–SNAP demantèle le complexe coiled-coil de quatres SNAREs
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La fusion membranaire est un processus cellulaire ubiquitaire qui se manifeste au niveau intracellulaire par le trafic vésiculaire, et au niveau extracellulaire, par exemple lors de l'infection par des virus, la fusion des gamètes au cours de la fécondation ou la formation des myotubes au cours du développement musculaire.

  

Pour en savoir plus, consultez les documents suivants : « SNARE common themes Antonin » (1627 Ko), et « SNAREs review Duman » (286 Ko).

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Un premier transit : du REr au Golgi par l'intermédiaire du compartiment ERGIC

 

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Un premier transit : du REr au Golgi par l'intermédiaire du compartiment ERGIC
Introduction

Ci-dessous nous décrirons les rôles des protéines liant le GTP (GTPases) dans la formation de vésicules bourgeonnantes provenant du REr et leur fusion subséquente qui donne naissance aux citernes cis -golgiennes, après passage par un intermédiaire : le compartiment ERGIC.

Figure 16C. Les différentes GTPases dans le transport de vésicules entre le REr et le Golgi

Figure 16C. Sites d'action de GTPases Sarl, Rabl et Arf dans le transport vésiculaire entre le REr et le Golgi

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Un premier transit : du REr au Golgi par l'intermédiaire du compartiment ERGIC
Première GTPase : Sar1 et son rôle dans le recrutement des protéines du manteau et de la charge

La GTPase Sar1 (« secretion associated ras-superfamily gene1 »), toujours liée à la membrane, est chargée de GTP par le facteur d'échange (GEF) Sec12p. Dans son état liant le GTP elle initie le tri de charge, en concentrant certaines protéines dans le domaine membranaire appelé « site de sortie » (qui forme progressivement un tube ou une vésicule, voir figure 17). Sar1–GTP recrute deux grands complexes, Sec23/24p et Sec13/31p. Leur attachement à la membrane et leur regroupement engendre la formation du manteau de type COPII. Cette charpente amorce la courbure de la membrane du REr, premier stade dans la formation du bourgeon.

Figure 17. Bourgeonnement d'une vésicule de transport : activation de Sar1

Figure 17. Bourgeonnement d'une vésicule de transport : activation de Sar1
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La protéine Sec24 joue un rôle important dans la fixation de la charge. Elle fixe des récepteurs transmembranaires qui contiennent un domaine diacidique, acide aspartique (D) et acide glutamique (E) dans des combinaisons DxD, DxE, ExD ou ExE, (en aval d'un résidu tyrosine clé) (cliquez sur les loupes de la figure 17 pour plus de détails). Plusieurs isoformes de Sec24 existent, chacune pouvant avoir une affinité différente pour la charge. La charge soluble est aussi reconnue par des récepteurs transmembranaires, à leur tour reconnus par des protéines du manteau. Par exemple, des glycoprotéines telles que la cathepsine Z et les facteurs de coagulation V et VIII, sont capturés par le récepteur-lectine ERGIC–53, lui-même reconnu par Sec24 par son motif dihydrophobe C–terminal (AKKFF–COOH). La protéine disulfure isomérase (PDI) et la chaperonne BiP sont capturées par une protéine transmembranaire qui fixe leur séquence lys–asp–glu–leu–COOH (KDEL), pour cela appelée récepteur KDEL (protéine 6 fois transmembranaire et d'un poids moléculaire de 37 kDa). Comme on le verra plus tard, le motif KDEL détermine aussi le transport rétrograde (du Golgi au REr).

Ensuite, Sec24 joue également un rôle important dans le recrutement de la machinerie de fusion : les Q–SNAREs, Syntaxine–5 (sed5), Sec22B et Membrine (Bos1) ; le R–SNARE, rBet1. La SM protéine rSly rejoint également les protéines de fusion (voir figure 18, et cliquez sur la loupe pour plus de détails).

Figure 18. Bourgeonnement d'une vésicule de transport du REr ; recrutement de SNAREs

Figure 18. Bourgeonnement d'une vésicule de transport du REr ; recrutement de SNAREs
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Tableau 2 : peptides de destination pour quitter le REr

Interaction directe (liaison à la protéine Sec24 du manteau COPII)

Liaison à Sec24 par le motif di-acidique

VSV–G
CFTR (NBD1)
GLUT4
LDLR
CI–M6PR
E–Cadhérine
EGFR
NGFR
GAP1p

TM–18aa
TM–212aa–
TM–36aa–
TM–36aa–
TM–26aa–
TM–95aa–
TM–58aa–
TM–65aa–
TM–xxaa

YTDIEMNRLGK
YKDADLYLLD
YLGPDEND
YLGPDEND
YSKVSKEEETDENE
YDSLLVFDYEGSGS
YKGLWIPEGEKVKIP
YSSLPPALREEVEKLLNG
AEKMDIDTGF

Liaison à Sec24 par le motif Lxx(L/M)E

Rbet1 (SNARE)   
Sed5 (SNARE)

Nterm
Nterm

LASLESQS
LMLMEEG

Liaison à Sec24 par le motif di-hydrophobe

ERGIC–53
p24delta1
ERv41p
KDEL récepteur

TM
TM
TM
TM

YIMYRSQQEAAKKFF
YLRRFFKAKKLIE
YQPDDKTKGILDR
YCDFFYLYITKVLKGKKLSLPA

 

Interaction indirecte (par l'intermédiaire du récepteur–KDEL ou –ERGIC–53)

Liaison au récepteur KDEL par le motif KDEL

BiP (Grp78)
PDI

GEEDTAEKDEL
DDDQKAVKDEL

Liaison au récepteur ERGIC–53 par le mannose9

Cathepsine Z
Facteur de coagulation V
Facteur de coagulation VIII

mannose9
mannose9
mannose9

Le processus sélectif dépendant d'un récepteur, qui vient d'être décrit, est probablement accompagné d'un transport en bloc, non-sélectif. En effet, au cours de leur bourgeonnement, les vésicules peuvent capturer accidentellement des protéines solubles. Si les protéines sont indésirables, elles sont alors soumises à un transport rétrograde, qui les renvoie vers le REr, dans des vésicules du type COPI (voir plus tard).

Le manque de l'activité Sar1p, dû à une mutation de la thréonine en position 39 (remplacée par l'asparagine, T39N) qui empêche l'échange de GDP par GTP, cause une complète dislocation de l'appareil de Golgi, démontrant ainsi la place unique du REr dans la biogenèse du Golgi.

  

La protéine ERGIC–53, est un récepteur-lectine (d'un poids de 53 kDa), dépendant du , à forte affinité pour le mannose et dont le nom est dû au fait qu'elle est particulièrement présente dans le compartiment intermédiaire ERGIC. L'ERGIC–53 est une protéine transmembranaire type 1 (C–terminal du coté cytoplasmique).

  

Pour en savoir plus, consultez les documents suivants : « COPII cargo selection overview » (80 Ko), et « COPII Sec23-24-Sar1 structure » (713 Ko).

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Un premier transit : du REr au Golgi par l'intermédiaire du compartiment ERGIC
Deuxième GTPase : Rab1 et son rôle dans le recrutement des protéines accessoires de fusion

Rab1 (« Rat brain1 ») s'insère dans la membrane du REr au niveau d'un « site de sortie » par deux chaînes géranylgéranyl (cliquez sur la loupe de la figure 19). Après le chargement en GTP, par RabGEF, Rab1 recrute les golgines (p115, GM130 et giantine, protéines d'arrimage de 50 nm de longeur) et l'ATPase NSF (voir figure 19). Comme cela a déjà été précisé plus haut, ces protéines sont indispensables dans la biogenèse du Golgi, mais leur rôle exact n'est pas encore connu Cependant, pour NSF on sait qu'il joue un rôle essentiel dans le démantèlement du complexe Q– et R–SNAREs sur la même membrane (« conformation-cis »). Le recrutement de p115 conduit à l'attachement au site de sortie d'autre protéines, telles que l'enzyme phospholipase–C1 et phospholipase D (qui changent la composition lipidique de la membrane de la vésicule bourgeonnante) et le facteur d'échange d'Arf1, GBF1 (Golgi-specific Breveldin–A–resistant factor).

Figure 19. Bourgeonnement d'une vésicule de transport du REr ; recrutement de Rab1 et des protéines d'arrimage

Figure 19. Bourgeonnement d'une vésicule de transport du REr ; recrutement de Rab1 et des protéines d'arrimage
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Golgines

Les golgines furent à l'origine identifiées comme un groupe d'antigènes de poids moléculaire variable (p115, p130, etc.), à localisation golgienne, reconnues par des antisérums (anticorps) provenant de patients souffrant de maladies auto-immunes variées.

Elles ont en commun de longues séquences d'acides aminés, connues pour former des structures en torsade (« coiled-coil »), créant ainsi des complexes protéiques en forme de bâtonnet (jusqu'à 50 nm de longueur, c'est-à-dire d'une dimension comparable à celle de la vésicule qui les portent). Les golgines sont en général des protéines cytoplasmiques solubles recrutées à la membrane par fixation aux GTPases de la famille Rab (dans leur état lié au GTP). Elles sont indispensables aux évènements d'arrimage précédant la fusion vésiculaire et, grâce à leurs interactions avec la tubuline, elles interviennent dans l'organisation structurale du Golgi.

  

Pour en savoir plus, consultez les documents suivants : « Golgins, Barr » (475 Ko), et « SNARE, rSly, Hay » (700 Ko).

Les structures vésiculaires (et tubulaires) ainsi mises en place, et chargées des protéines destinées au Golgi, vont ensuite se séparer du REr (fission). Presque simultanément, le GTP de Sar est hydrolysé et le manteau COPII se disloque (sans perte de la machinerie de fusion). Les vésicules alors libérées (60-90 nm de diamètre environ) fusionnent entre elles, fusion homotypique, par un processus dirigé par Rab1, p115 et les SNAREs. Ensemble, elles donnent naissance à des cavités irrégulières (d'une taille d'environ 0,4-1,0 ) formant le compartiment ERGIC (ER Golgi intermediate carrier) (voir figure 20).

Figure 20. Formation du compartiment ERGIC

Figure 20. Formation du compartiment ERGIC

  

Consultez le site web d'un laboratoire performant sur le sujet :
http://www.curie.fr/recherche/themes/detail_equipe.cfm/lang/_fr/id_equipe/24.htm

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Un premier transit : du REr au Golgi par l'intermédiaire du compartiment ERGIC
Troisième GTPase : Arf1 et son rôle dans la transformation du compartiment ERGIC en citerne cis-golgienne

Le compartiment ERGIC est aussi alimenté par des vésicules de fusion qui proviennent de la face cis-golgienne (transport rétrograde) lors d'un processus qui implique les SNAREs et les golgines (GM130, giantine et p115). Ces vésicules cis-golgiennes, appelées vésicules COPI apportent une troisième GTPase, Arf1 (ADP ribosylation factor). Arf1 a une forte parenté de séquence avec Sar1. Après son chargement en GTP par le facteur d'échange GBF1, Arf1 est indispensable à la transformation du compartiment ERGIC en citerne cis-golgienne. Arf1–GTP recrute de nombreuses protéines cytosoliques dont la phospholipase–D (PLD) (cliquez sur la loupe de la figure 21) et les phosphatidylinositol kinases (PI kinases) pour modifier les lipides membranaires et leur conférer leur caractère golgien très différent de celui du REr (voir figure 21).

Figure 21. Arf1 et la transformation d'ERGIC en citerne cis-golgienne

Figure 21. Arf1 et la transformation d'ERGIC en citerne cis-golgienne
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Arf1 lie aussi le compartiment ERGIC aux microtubules (cytosquelette) en recrutant la protéine dynéine–1 (protéine motrice qui migre vers l'extrémité moins du microtubule), l'adaptateur dynactine et la protéine non-motrice GMAP–210 (Golgi microtubule associated protein 210) (voir figure 21 et cliquez sur les deux loupes pour plus de détails). Ces protéines sont nécessaires à la fois au déplacement du compartiment ERGIC et à la stabilisation des citernes cis-golgiennes. Les évènements qui conduisent à la transition entre ERGIC et Golgi demeurent encore mal connus.

Le verrouillage de l'Arf dans son état GDP, par remplacement du résidu thréonine 31 en asparagine (T31N) ou par traitement de la cellule par la bréfeldine (métabolite fungique qui inhibe le facteur d'échange GBF1) ne gène pas le bourgeonnement de vésicules à partir du REr mais bloque la biogénèse du Golgi (en bloquant la maturation de l'ERGIC en cis Golgi) (voir figure 22)

Figure 22. La dissolution de Golgi après l'inhibition de l'Arf

Figure 22. La dissolution de Golgi après l'inhibition de l'Arf

  

Pour visualiser de façon plus précise la complexité du Golgi, nous suggérons de consulter les documents suivants : « Les principes de la tomographie McIntosh » (487 Ko), et « Le Golgi en tomographie McIntosh » (1367 Ko).

 

  Partez en excursion : rôle des protéines liant le GTP dans la dynamique de transport vésiculaire

 

  

Pour en savoir plus, consultez les documents suivants : « COPII Antonny-Schekman » (77 Ko), « Turning on Arf, Jackson-Casanova » (1306 Ko), et « PLD Golgi Freyberg » (363 Ko).

  

Consultez le site web d'un laboratoire performant sur le sujet :
http://www.cmc-utrecht.nl/Staff/Catherine_Rabouille/indexcatherine.htm

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Un deuxième transit : passage au travers du Golgi

Les protéines traversent le Golgi en 30 minutes dans le sens cis vers trans. Au cours de ce passage, la plupart d'entre elles subissent un remaniement de leur portion glucidique, de leurs ponts disulfures et quelquefois une protéolyse partielle. Ici nous nous attarderons surtout sur le remaniement glucidique.

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Un deuxième transit : passage au travers du Golgi
Passage de la charge au travers du Golgi : transport antérograde

Le processus de traversée du Golgi par la charge fait encore l'objet de discussions. Nous adoptons le modèle de la « maturation des citernes » aussi connu comme le « modèle de progression des citernes ».

Dans ce modèle, les citernes cis-golgiennes qui sont fournies par le compartiment ERGIC, progressent graduellement en direction de la région trans golgienne. Au cours de ce mouvement, les N–glycanes sont modifiés et les O–glycanes sont ajoutés, réalisant ainsi la « maturation » des glycoprotéines. Pour être maintenus dans la localisation qui leur est propre (localisation relative dans l'empilement des citernes), les enzymes (et les transporteurs d'oses) sont capturés dans des vésicules bourgeonnant à partir des citernes progressantes, pour regagner la citerne précédente au cours d'un transport qualifié de rétrograde (voir figure 23).

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Un deuxième transit : passage au travers du Golgi
Passage de la charge au travers du Golgi : transport rétrograde par des vésicules COPI

Ce transport, réalisé par des vésicules tapissées COPI (coat proteins type I) est présent à tout niveau de l'empilement golgien. La formation de vésicules COPI s'effectue comme celle de vésicules COPII. L'assemblage du manteau est initié par Arf1, qui lorsqu'elle est liée au GTP recrute deux complexes protéiques (« coatomer ») : complexe F composé de COP– et et complexe B, composé de COP– et . Certains composants de COPI agissent comme des récepteurs mais les motifs qu'ils reconnaissent demeurent peu connus. Le manteau en construction recrute à son tour les Q–SNAREs (syntaxine–5 (+rSly), membrine, Rbet) et la R–SNARE (Sec22b), les protéines d'arrimage, les protéines accessoires de fusion et la GTPase Rab1. Au fur et à mesure de l'augmentation de sphéricité de la vésicule, Arf1 est hydrolysé, entraînant la perte du manteau et rendant la vésicule dénudée prête à la fusion avec le compartiment précédent (voir figure 23, et cliquez sur la loupe pour plus de détails).

Figure 23. Transport dans le Golgi

Figure 23. Transport dans le Golgi
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Le transport rétrograde atteint également le REr de façon à compenser la perte de membrane consécutive au mouvement antérograde et à retourner vers le REr la charge protéique qui lui est spécifique. Trois protéines sont particulièrement concernées : la disulfure isomérase PDI, la protéine chaperonne BiP et le récepteur des glycoprotéines ERGIC–53. On sait que COP– reconnaît le motif dilysine (KKxx or KxKxx) présent : 1/ dans le récepteur KDEL, qui lui-même fixe les protéines solubles BiP et PDI, et 2/ dans ERGIC–53, protéine membranaire. Par le transport antérograde et rétrograde ces protéines font l'objet d'une navette entre le REr et le Golgi. Enfin, le transport rétrograde sert aussi à éliminer les protéines « usées » du Golgi qui, une fois arrivées dans le REr, sont dirigées vers le canal de translocation en direction des protéasomes.

  

Consultez le site web d'un laboratoire performant sur le sujet :
http://www.ipmc.cnrs.fr/pages/antonny.htm

 

  Partez en excursion : courbure membranaire et hydrolyse du GTP lié à Arf1

 

  

Les algues à écailles et le modèle de la « maturation des citernes »

Chrysochromulina chiton est une algue microscopique (0,5-2,0 ) du groupe des prymnésiophytes dont le tégument est couvert de plusieurs couches d'écailles protéiques. Ces écailles sont élaborées dans l'appareil de Golgi, positionné à la base du flagelle. Des études menées en 1967 par une pionnière de la microscopie électronique, Irene Manton (Université de Leeds, Royaume Uni), ont illustré le modèle de la maturation des citernes. Les images montrèrent la présence d'écailles partiellement assemblées dans les citernes cis et d'écailles matures dans les citernes en position trans terminale. Aucune écaille n'a été observée dans des vésicules de transport suggérant que ce sont les citernes elles-mêmes (avec leur contenu) qui progressent dans le sens cis trans.

  

Article I Manton. Further observations on the fine structure of Chrysochromulina chiton with special reference to the haptonema, « peculiar » Golgi structure and scale production. J Cell Sci 1967, 2: 265-272.

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La glycosylation dans le Golgi

 

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La glycosylation dans le Golgi
Enzymes impliquées

Pour la plupart, les protéines membranaires sont des glycoprotéines, qui toutes sont N–glycosylées (sur le résidu asparagine), mais parfois aussi O–glycosylées (par des branches oligosaccharidiques sur des résidus thréonine ou sérine). La N–glycosylation se fait dans le REr, mais la cupule glucidique greffée est ensuite substantiellement modifiée dans le Golgi. Nous avons déjà évoqué les diverses enzymes impliquées dans la N–glycosylation telles que les glycosidases (la glucosyltransférase, UGGT) et les glycosyltranférases (glucosidase I et II, et mannosidase I). Ajoutons ici deux autres protéines : 1/ le transporteur de ose–nucléotide qui, par mode antiport, échange un ose couplé à un nucléotide diphosphate contre un nucléotide monophosphate et 2/ la nucléotide diphosphatase, qui assure la conversion du nucléotide diphosphate en nucléotide monophosphate. Toutes ces enzymes (et les transporteurs) sont produits dans le REr et transportés en tant que charges vers les citernes golgiennes.

Il est important de réaliser que les substrats et leurs enzymes sont déjà ensemble dans le REr mais que leurs activités respectives ne s'expriment que dans des citernes golgiennes spécifiques. Cette régulation spatiale et temporelle demeure encore énigmatique.

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La glycosylation dans le Golgi
Elaboration de glycoprotéines et de protéoglycanes

Après la N–glycosylation, la majorité des protéines entrant dans le Golgi possèdent une cupule glucidique (GlcNac2Man9) qui va être élaguée par la mannosidase–2, ne laissant que 3 à 5 résidus mannose (en plus des deux GlcNac) (voir la figure 24). La N–acétylglucosaminetransférase qui agit ensuite, dicte le type de branchement des nouveaux oses greffés. Après le rajout des acétylglucosamines, les branches sont allongées par des di–saccharides composés de galactose–N–acétylglucosamine (en formant des chaînes polylactosamine). Après une ou plusieurs additions de ces di–saccharides, les chaînes sont terminées par l'ajout de galactose, de N–acétylgalactosamine, de L–fucose, d'acide sialique ou d'un groupement sulfate.

Figure 24. Etapes de glycosylation dans le Golgi

Figure 24. Etapes de glycosylation dans le Golgi

Un autre processus consiste en la formation de très longues chaînes par répétition d'un motif disaccharidique du type galactose et N–acétylglucosaminesulfate (kératane) ou du type acide–D–glucuronique et N–acétylglucosaminesulfate (chondroïtine sulfate). On parle alors de protéoglycanes au lieu de glycoprotéines. Dans la ressource sur les « molécules d'adhérence », nous avons déjà évoqué l'exemple de l'aggrécane, protéoglycane majeur du cartilage hyalin).

La glycosylation se fait sans matrice préexistante. Cependant, le nombre limité de séquences oligosaccharidiques présentes sur les protéines et les lipides, suggère qu'un ordre existe. Cet ordre est probablement dû à deux mécanismes au moins : 1/ séquestration de glycosyltransférases, glycosidases et de transporteurs de nucléotide–sucres dans certaines citernes golgiennes (compartimentation des activités enzymatiques résultant en une véritable chaîne de montage), et 2/ amas d'enzymes et transporteurs de nature spécifique, assurant simultanément une séquence précise (et probablement définitive) de modifications d'une seule chaîne glucidique.

La réalité de ses deux mécanismes est bien démontrée. Certaines glycosyltransférases sont restreintes à une ou deux citernes golgiennes précises ; par exemple, N–acétylglucosaminyl transférase ne se trouve que dans les citernes médianes. A l'inverse, les trois types de N–acétylgalactosyl transférases sont présents dans toutes les citernes golgiennes. On trouve aussi des associations d'enzymes, par exemple mannosidase–2 avec N–acétylglucosyl transférase ou encore sialyl–transférase–1 avec galactosyl–transférase–1 et sialyl–transférase–2. Le signal de rétention spécifique réside probablement dans la portion N–terminale cytoplasmique de ces enzymes et les mécanismes précis restent encore à élucider.

NB : La grande chaîne de glycosaminoglycanes qui constitue l'acide hyaluronique est assemblée dans le cytoplasme et non dans le Golgi. Rappelons que ce glycosaminoglycane est un composant très courant de la matrice extracellulaire mais jamais lié aux protéines par covalence.

  

Glycosylation et viabilité cellulaire

Dans des cultures cellulaires, la N–glycosylation dans le REr, c'est-à-dire l'ajout de la cupule glucidique, est indispensable à la viabilité de la cellule. En revanche, l'absence des modifications ultérieures qui amènent à l'élaboration de chaînes oligosaccharidiques complexes, n'a pas de conséquences néfastes pour la cellule. Cependant, chez des embryons de souris, le manque de N–acétylglucosamine transférase–1, enzyme clé dans la formation de branches glucidiques, se traduit par la mort fœtale vers la mi-gestation (2 semaines).

On connaît peu de choses à propos de l'importance de l'O–glycosylation. La présence de longues chaînes glucidiques doit avoir un effet sur : 1/ la conformation des protéines et 2/ l'accès de certaines protéases (et donc réduction des risques de protéolyse). De plus, ces chaînes de glucides sont impliquées dans les interactions cellule–cellule dues aux molécules d'adhérence. Par exemple GlyCAM, CD34, MadCAM–1 et PSGL sont fortement glycosylées et interagissent avec des lectines.

Figure 25. Glycoprotéines : partie protéique en bleu et glucidique en rouge

Figure 25. Glycoprotéines : partie protéique en bleu et glucidique en rouge

 

  Partez en excursion : les glycosyltransférases

 

  

Pour en savoir plus, consultez les documents suivants : « glycosylation review Kornfeld » (2109 Ko), et « sugar glycosyltransferases Paulson » (573 Ko).

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La glycosylation dans le Golgi
Une modification spécifique : la formation de mannose–6–phosphate, « glucide de destination » des enzymes lysosomiques

Par un exemple précis, la glycosylation de la protéase cathepsine L (38 kDa sans glucides), nous documentons ci-après la modification particulière de la cupule glucidique, spécifique aux enzymes à destination du lysosome : la C6–phosphorylation du mannose.

Figure 26. Phosphorylation du mannose en position 6 sur pro-cathepsine L

Figure 26. Phosphorylation du mannose en position 6 sur pro-cathepsine L

La cathepsine quitte le REr sous forme de pro-enzyme, la pro-cathepsine, portant la cupule de N–glycosylation sur l'asparagine–221. Dans le cis-Golgi, un mannose de la branche interne est enlevé par la mannosidase type–2. La protéine est ensuite reconnue, problablement grâce à la présence de deux lysines situées en position 54 et 99 (pour la pro-cathepsine L murine), par la N–acétylglucosamine–1 phosphotransférase (un complexe protéique de 540 kDa composé de sous-unités et et de deux sous-unités ). Cette enzyme ajoute un N–acétylglucosamine–phosphate (à partir d'un UDP–GlcNac) sur le carbone–6 d'un ou plusieurs mannoses de la cupule (voir figure 26). Les mannoses concernés ne sont pas bien définis en raison de la grande mobilité des chaînes glucidiques. Pour finir, dans le compartiment golgien médian, les groupements N–acétylglucosamine sont éliminés par une phosphodiestérase laissant le seul groupement phosphate sur le(s) mannose(s). Toutes les enzymes lysosomales sont traitées de la sorte, si bien que le mannose–6–phosphate sert comme « glucide de destination » lysosomal.

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Troisième transit : tri vers les différents compartiments, lysosome primaire et vésicule de sécrétion

Après avoir été modifiées (maturées), les protéines arrivent dans la zone trans golgienne où elles vont être soumises à un tri qui les orientera vers leur site de destination. Certaines seront dirigées vers le lysosome, d'autres sont stockées dans des vésicules de sécrétion (en attendant l'exocytose) et d'autres enfin seront directement, par des vésicules de transport, amenées vers la membrane plasmique pour y être incorporées ou être déversées dans le milieu externe (composants de la matrice extracellulaire) (voir figure 27).

Figure 27. Tri des protéines (et lipides) dans la zone trans-golgienne

Figure 27. Tri des protéines (et lipides) dans la zone trans-golgienne

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Troisième transit : tri vers les différents compartiments, lysosome primaire et vésicule de sécrétion
Vers le lysosome primaire grâce au récepteur du mannose–6–phosphate (exemple de la pro-cathepsine L)

Dans le réseau trans golgien le mannose–6–phosphate présent sur certaines protéines sera reconnu par deux récepteurs transmembranaires, membres de la famille des lectines de type–p. L'un est le récepteur dépendant des cations, , CD–MPR (de 46 kDa), et l'autre est le récepteur indépendant des cations, CI–MPR (de 300 kDa). Tous deux fonctionnent sous la forme d'homodimères.

  

CI–MPR fixe plusieurs ligands

CI–MPR, qui a la capacité de fixer deux mannoses–phosphate, est composé de 15 motifs contigus identiques chacun ressemblant au domaine cytoplasmique du CD–MPR (qui fixe un seul mannose–phosphate). Certains des motifs de CI–MPR ont également la capacité de fixer le facteur de croissance « insulin like » (IGFII), le récepteur de l'urokinase (uPAR) et le plasminogène (impliqué dans la coagulation sanguine). Il apparaît donc que le CI–MPR possède des fonctions qui vont bien au delà de la ségrégation des enzymes lysosomales. Pour exemple une perte de la fonction du CI–MPR est associée à certains cancers humains.

Les récepteurs MPR sont reconnus et séquestrés dans des vésicules bourgeonnantes par des protéines cytosoliques, GGA1, 2 ou 3 (Golgi-localized, Gamma-ear containing Arf binding proteins, poids moléculaire de 70 kDa). Ces protéines interagissent (par leur domaine VHS) avec le domaine cytoplasmique des récepteurs MPR (DDHLLP pour CD–MPR et DEDLLH pour CI–MPR), évitant ainsi que les récepteurs quittent le Golgi avec les protéines destinées aux autres compartiments. Ainsi que le suggère leur appellation, les GGA sont recrutées à la membrane par la GTPase Arf1. Dans la citerne trans-golgienne, le MPR échange la GGA contre un adaptateur protéique, AP–1A (adaptor protein–1A, avec la chaîne notée 1A). AP–1A fixe la séquence DGCDFVCRSKPRNVP présente dans le C–terminal cytosolique des MPRs. La vésicule doit alors acquérir une machinerie de fusion (les Q–SNAREs, syntaxine–6, syntaxine–13 et vti1a, et la R–SNARE, VAMP–4) pour pouvoir gagner, plus tard, d'autres compartiments cellulaires (voir figure 28, et cliquez sur les trois loupes pour plus de détails). Le complexe recrute également des protéines motrices kinésine-like (KIF13A) qui assurent le transport des vésicules sur les microtubules. Enfin, l'arrivée de clathrine, protéine du manteau, permet la naissance d'une véritable vésicule, visible en microscopie électronique, et appelée « vésicule tapissée de clathrine ». Après le détachement de la vésicule le manteau se disloque, grâce à la chaperonne Hsc70 et son partenaire auxiline qui fixent la chaîne lourde de clathrine. Dès lors, la vésicule nue, appelée lysosome primaire, est prête pour fusionner avec l'endosome qui devient alors lysosome (ou encore lysosome secondaire).

Figure 28. Recrutement de pro-cathepsine L dans le lysosome primaire

Figure 28. Recrutement de pro-cathepsine L dans le lysosome primaire
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En conclusion, la ségrégation des enzymes lysosomales est déterminée par un « glucide de destination » et non pas par un « peptide de destination » comme c'est le cas des autres protéines.

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Troisième transit : tri vers les différents compartiments, lysosome primaire et vésicule de sécrétion
Recyclage des récepteurs MPR

De nombreux récepteurs, y compris les MPRs, s'échappent des endosomes précoces et tardifs, pour être recyclés. Pour ce qui concerne les MPRs, ils sont rassemblés dans une région bourgeonnante de l'endosome (analogue à « un site de sortie »). Dans le cas d'un endosome précoce, ceci implique l'intervention de protéines PACS–1 et AP–1, qui provoquent la formation d'une vésicule tapissée de clathrine. Dans le cas d'un endosome tardif, le processus requiert la présence de protéines cytosoliques TIP47 et Rab9 liant le GTP.

  

Consultez le site web d'un laboratoire performant sur le sujet :
http://www.cmc-utrecht.nl/Staff/Hans_Geuze/projectshans.htm

  

Pour tout savoir sur les nombreux peptides de destination portés par le récepteur du mannose–6–phosphate, consultez le document suivant : « mannose-P Receptor review Ghosh-Kornfeld » (2158 Ko).

  Partez en excursion : le récepteur du mannose–6–phosphate CI–MPR régule la prolifération et la motilité cellulaire

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Troisième transit : tri vers les différents compartiments, lysosome primaire et vésicule de sécrétion
Le point sur les endosomes (précoces et tardifs) et les lysosomes (primaires et secondaires)

Les endosomes forment un compartiment cellulaire issu du processus d'endocytose, caractérisé par l'invagination de la membrane plasmique et la formation de vésicules (mécanisme très proche de la formation des vésicules bourgeonnantes des REr et Golgi). Ces vésicules fusionnent entre elles pour former un compartiment de forme irrégulière appelé endosome précoce. L'endosome précoce se transforme en endosome tardif (ou corps multivésiculaire) caractérisé par de nombreuses invaginations et vésicules internes. L'endosome tardif se transforme en lysosome (ou encore lysosome secondaire). Enfin, une fois le contenu dégradé le lysosome gagne l'état de corps résiduel (ce sujet est abordé en détail à la fin de cette ressource).

Les transformations successives surviennent en raison de la fusion des vésicules riches en hydrolases (lysosomes primaires) provenant du réseau trans-golgien avec les endosomes précoces et tardifs. Les transformations sont accompagnées par une acidification progressive du contenu endosomal due à l'intervention d'une pompe –ATPase type V (vésiculaire). Dans le contexte de la maturation des hydrolases, l'acidification a deux effets : 1/ découplage de la charge protéique de son récepteur et 2/ protéolyse partielle (par une cystéine protéase) de la pro-hydrolase. La pro-cathepsine L (murine) possède trois sites de clivage : après le résidu 144, pour enlever le pro-peptide, après les résidus 288 et 290 pour former une chaîne lourde et une chaîne légère (revoir la cathepsine D). Le mannose perd enfin son phosphate et l'enzyme est alors prête à agir (voir figure 29).

Figure 29. Activation de la cathepsine L

Figure 29. Activation de la cathepsine L
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La membrane du lysosome primaire contient un lipide original : l'acide lyso-biphosphatidique. Elle contient également de nombreuses protéines transmembranaires, les pompes et transporteurs, mais, de loin, les protéines les plus abondantes sont les Lamps (lysosome-associated membrane protein) et la Limp (lysosome integral membrane protein), toutes deux fortement N–glycosylées. Elles sont résistantes aux activités des hydrolases. La présence de motifs GY ou IL permet à ces protéines de lier directement, au niveau du réseau trans golgien, les protéines du manteau AP–1A (ou AP3).

  Partez en excursion : les hydrolases du lysosome primaire

Ici, nous traiterons des différentes hydrolases présentes dans le lysosome primaire et des pathologies associées à leur absence ou à leurs anomalies. Nous montrerons aussi comment expérimentalement l'α–galactosidase, en modifiant la composition de la chaîne de glucides, convertit l'antigène du groupe sanguin B en O.

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Troisième transit : tri vers les différents compartiments, lysosome primaire et vésicule de sécrétion
Vers la voie de sécrétion constitutive

La sécrétion constitutive est une activité exercée par la plupart des cellules dans le but de fournir la membrane en lipides et protéines et de maintenir la matrice extracellulaire (collagène, fibronectine, laminine, protéoglycanes et aussi protéases responsables du remaniement de la matrice). Toutes ces substances synthétisées par la cellule sont insérées dans la membrane plasmique ou libérées dans l'environnement par le processus dit d'exocytose, fusion d'une vésicule de sécrétion avec la membrane plasmique. On ne sait pas encore exactement comment la charge qui subit ce transport constitutif est sélectionnée. Les vésicules de transport de la voie constitutive sont pourvues de la machinerie nécessaire à la fusion à la membrane plasmique : les Q–SNAREs Syntaxine–4 (liée à Munc18b/c), SNAP–23 (N–terminal), SNAP–23 (C–terminal), la R–SNARE cellubrévine et plusieurs GTPases de la famille Rab (dans laquelle Rab3a est dominante).

Dans les cellules épithéliales, où la jonction serrée délimite un domaine apical et un domaine basolatéral, la distribution des protéines membranaires ne peut pas se faire au hasard. Deux stratégies au moins semblent impliquées : une voie dite directe (sélection au niveau du réseau trans-golgien) et une autre dite indirecte (sélection par l'intermédiaire de l'endosome) (voir figure 33 et cliquer sur la loupe pour plus de détails).

Figure 33. La voie de sécrétion constitutive

Figure 33. La voie de sécrétion constitutive
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Dans la voie directe, la destination « basolatérale » est signalée par la présence d'un motif amino acidique, tyrosine (Y) ou di-leucine (LL), ainsi que cela a été démontré pour le récepteur des lipoprotéines de faible densité (R–LDL), pour le récepteur de la transferrine (qui permet l'apport de fer à la cellule), pour le récepteur du mannose–6–phosphate (CI–MPR) et pour le récepteur des immunoglobulines polymériques (nécessaire à la sécrétion des IgA et IgM dans le mucus). Le complexe AP4 intervient dans la sélection de ce motif et les vésicules bourgeonnent sans intervention de la clathrine (cas unique pour le complexe AP4).

La destination « apicale » est signalée par la présence de l'ancre membranaire glycosylphosphatidylinositol (GPI) et le domaine de liaison de la cavéoline (ou est un acide aminé aromatique tel que le tryptophane (W), la phénylalanine (P) ou la tyrosine (Y)). Certains récepteurs et des protéines membranaires intrinsèques sont apportés à la membrane plasmique par un tel mécanisme. Des exemples concernent le récepteur de l'insuline, des récepteurs de facteurs de croissance tels que PDGF et EGF et la protéine G hétérotrimérique. Ces protéines seront traitées dans une ressource ultérieure sur la « signalisation cellulaire ». En effet, la plupart des protéines qui les possèdent aboutissent dans les vésicules trans-golgiennes, destinées à la membrane plasmique apicale, riches en sphingomyéline, cholestérol (composants de radeaux lipidiques) et cavéoline–1 (protéine de poids moléculaire 21 kDa) (cliquez sur la loupe de la figure 33). La cavéoline existe sous plusieurs formes appelées cavéoline–1, 2 et 3. L'expression de cavéoline–3 est limitée aux cellules musculaires.

La voie indirecte résulte d'abord dans la distribution aléatoire des protéines membranaires puis dans leur endocytose suivie par leur redistribution sélective (basolatérale ou apicale) à partir de l'endosome précoce (aussi connu comme « endosome de recyclage »). La sélection dans l'endosome précoce est réalisée par la protéine du manteau AP–1B (ainsi nommée pour la présence de la chaîne  type 1B). La charge sélectionnée est prélevée par une vésicule tapissée de clathrine qui s'achemine vers la membrane basolatérale et s'associe avec elle grâce à la présence d'un complexe protéique (poids moléculaire de 743 kDa) appelé exocyste (localisé près de la zonula adherens). L'exocyste, ou complexe Sec6/8, est constitué de huit protéines, Sec3, 5, 6, 8, 10, 15, 70 et 84, associées avec les Q–SNAREs de la famille de la syntaxine et de SNAP. L'interaction initiale entre vésicule de sécrétion et exocyste est réalisée par la liaison de la GTPase Rab11 (état GTP) avec Sec15.

Les protéines endocytées mais non sélectionnées par AP–1B, quittent aussi l'endosome précoce par bourgeonnement d'une vésicule qui, cette fois, se dirige vers la membrane apicale.

Dans la figure 34, nous montrons que les protéines (ou domaines protéiques) qui étaient à l'intérieur de REr, Golgi ou des vésicules de transport, se retrouveront à l'extérieur de la cellule après la fusion avec la membrane plasmique.

Figure 34. Après fusion, l'intérieur se retrouve en position extracellulaire

Figure 34. Après fusion, l'intérieur se retrouve en position extracellulaire

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Troisième transit : tri vers les différents compartiments, lysosome primaire et vésicule de sécrétion
Vers la voie de la sécrétion contrôlée

La troisième voie de tri à partir du réseau trans-golgien conduit à la formation de vésicules qui ne fusionnent avec la membrane plasmique qu'après avoir reçu un signal qui initie la fusion. La charge protéique des vésicules résulte de mécanismes de tri que l'on pense très divers étant donné qu'aucun motif commun n'a été mis en évidence dans les protéines concernées.

Cette voie contrôlée est très représentée dans des cellules spécialisées dans la libération rapide sur demande, de produits tels que les hormones, les enzymes digestives (produites respectivement par les glandes endocrines et exocrines) ou les neurotransmetteurs. Souvent, le contenu de ces vésicules subit une concentration, favorisée par l'addition de et l'abaissement du pH (par l'–ATPase type V), deux facteurs qui favorisent l'agrégation des protéines (voir figure 35). En microscopie électronique ce processus est matérialisé par la présence de granules de morphologie variable : grands et immatures près du réseau trans-golgien jusqu'aux granules matures, petits et denses (dénommés alors granules de sécrétion), accumulés immédiatement sous la membrane plasmique et donc prêts à fusionner avec elle. Pendant la maturation, des pro-hormones convertases (PC1 et PC2, identifiées chez les mammifères) assurent des coupures spécifiques après des motifs dibasiques (arg–arg, arg–lys, lys–arg, lys–lys). D'autres enzymes sont chargées de sulfater les oligosaccharides des glycoprotéines. Toutes ces enzymes de maturation ne seront pas sécrétées car elles auront été éliminées avant l'exocytose par bourgeonnement de vésicules tapissées de clathrine.

Figure 35. Maturation et libération d'insuline

Figure 35. Maturation et libération d'insuline
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Le caractère tardif de ces modifications trouve des justifications variées : par exemple, 1/ la forme précurseur des enzymes digestives (les zymogènes) évite leurs effets délétères pour la cellule qui les produit ; et 2/ des peptides de petite taille, tels que les enképhalines (qui se fixent aux récepteurs opioïdes), sont trop courts pour être transportés à travers l'appareil de Golgi dans leur forme mature de pentapeptides ; 3/ les protéines doivent garder leurs peptides de destination le plus longtemps possible (cliquez sur la loupe de la figure 35 pour une illustration des modifications de la pro-insuline et de la prohormone POMC).

  

Modification des précurseurs protéiques dans la vésicule de sécrétion : exemple de la POMC

Les neuropeptides sont produits par coupure d'une prohormone en plusieurs séquences amino acidiques par des enzymes appelées prohormone–convertases 1 et 2 (qui coupent la chaîne polypeptidique après des paires de résidus basiques formées par la lysine (K) et l'arginine (R)). Au deuxième plan de la figure 35, nous montrons comment la protéine POMC de 30 kDa peut potentiellement donner naissance à neuf peptides différents. En fonction du type de cellule hypophysaire, type « corticotrope » ou type « mélanotrope », ce précurseur est « converti » en ACTH, –MSH, –endorphine et –LPH ou en NTP, 3–MSH, –MSH, –LPH et –endorphine, respectivement.

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Sécrétion d'insuline

Lorsque le glucose sanguin pénètre dans la cellule pancréatique– grâce au transporteur GLUT–2, il augmente la concentration cellulaire d'ATP en alimentant la glycolyse (suivie par le cycle de l'acide citrique et la phosphorylation oxydative dans la mitochondrie). Les taux d'ATP et d'ADP contrôlent l'ouverture d'un canal formé de deux sous-unités (chacune en quatre exemplaires) : 1/ le pore, constitué par la protéine Kir6.2 (canal composé de 4 sous-unités identiques de 45 kDa) qui se ferme sous l'effet direct d'ATP et 2/ la sous-unité régulatrice, constituée par la protéine SUR1 (sulfonylurea receptor1, protéine de 140 kDA et membre de la famille de transporteurs ABC) qui ouvre le pore en présence d'ADP. La fermeture du canal–, provoquée par l'augmentation de la concentration d'ATP, entraîne une dépolarisation de la membrane plasmique responsable de l'ouverture de canaux –voltage dépendants (L–VDCC) et donc une augmentation du libre intracellulaire. Le se fixe à la synaptotagmine–9 (protéine de 60 kDa) dont les domaines C2A et C2B se lient à la membrane plasmique, phénomène tenu pour responsable de l'ouverture du pore de fusion des vésicules sécrétoires contenant l'insuline (voir figure 35).

La libération d'insuline permet, surtout pour ce qui concerne les cellules hépatiques et musculaires (et à l'exclusion des cellules nerveuses), la capture du glucose sanguin excédentaire (par le transporteur GLUT–4) et son stockage sous forme de glycogène (par l'activation de la glycogène synthétase et l'inactivation de la phosphorylase).

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Troisième transit : tri vers les différents compartiments, lysosome primaire et vésicule de sécrétion > Vers la voie de la sécrétion contrôlée
Libération de neurotransmetteurs

La charge des vésicules de sécrétion impliquées dans la neurotransmission n'est pas toujours de nature protéique (c'est-à-dire produite dans le REr et modifiée dans le Golgi). Par exemple, dans le cas de l'acétylcholine, l'adrénaline, la noradrénaline, la dopamine, le glutamate, le GABA, la glycine, la sérotonine et l'histamine, il s'agit de petites molécules qui seront synthétisées dans le cytosol puis chargées dans les vésicules (synaptiques) de 40 nm de diamètre. Cependant, le Golgi intervient fortement en tant que pourvoyeur : 1/ de membrane, 2/ de machinerie de fusion, 3/ de pompe à protons (–ATPase type V, de 15 nm) qui met en place un gradient de protons et 4/ de transporteurs de neurotransmetteurs qui, dans la plupart des cas, utilisent le gradient de protons selon le mode antiport de transport. En effet, les vésicules synaptiques ont un pH d'environ 5,3 et la concentration des catécholamines qu'elles contiennent est estimée à 0,7 M (infiniment supérieure à leur concentration cytoplasmique qui est de l'ordre de la mM) (voir figure 36).

La membrane vésiculaire porte également la R–SNARE synaptobrévine (aussi appelée VAMP (vesicle associated membrane protein) et plusieurs GTPases Rab, dont Rab3A (la plus abondante) ainsi que Rab5 et Rab11. Elle porte aussi la complexine, protéine dont on pense qu'elle stabilise le complexe coiled-coil de SNAREs et la phosphatidylinositol 3–kinase, recrutée par Rab5 et pouvant jouer un rôle dans l'activation du complexe de fusion. Rab3A recrute la protéine MyRIP (myosine Rab–Interacting Protein), une protéine qui fixe la myosine et qui est impliquée dans le regroupement des vésicules à proximité de la membrane par ancrage aux filaments d'actine. Enfin, et de façon déterminante, la vésicule synaptique apporte les protéines sensibles au , synaptotagmine 1a et 2a, nécessaires à l'exocytose –dépendante (sécrétion contrôlée).

Figure 36. Formation des vésicules de neurotransmetteurs, exemple de l'acétylcholine

Figure 36. Formation des vésicules de neurotransmetteurs, exemple de l'acétylcholine

Une fois chargées, les vésicules synaptiques migrent vers une zone précise de la membrane plasmique que l'on appelle « zone active ». Les microtubules jouent un rôle dans le déplacement des vésicules et les filaments d'actine, surtout situés sous la membrane plasmique (actine corticale) participent au regroupement des vésicules. Certaines vésicules traversent la zone d'actine corticale et se lient à la membrane, phénomène nommé « arrimage », sans qu'il y ait forcément fusion immédiate (voir figure 35).

La zone active de la synapse, aussi appelée « cytomatrice présynaptique », est une région riche en machinerie de fusion : on y trouve les Q–SNAREs (syntaxine–1A/B et SNAP–25, synaptosomal associated protein, de 25 kDa), Munc18, d'autres protéines non transmembranaires telles que Munc13, ERC1b et ERC2 (Elks/Rab3–interacting molecule/CAST), Rim1a/2a (Rab–interacting molecules) et les –liprines (1–4), l'ensemble pouvant être comparé à l'exocyste évoqué dans le paragraphe précédent (NB la plupart des protéines ne sont pas illustrées dans la figure 35 pour éviter une surcharge de l'image).

Munc18 est associé au domaine N–terminal de la syntaxine–1 mais son implication exacte dans le processus de fusion membranaire apparaît paradoxale : d'une part munc18 peut garder la syntaxine–1 dans un état replié sur elle-même (fermé), évitant ainsi sa séquestration dans la vésicule bourgeonnante (et donc la formation de complexes trans-SNAREs) mais d'autre part son absence chez la levure et la souris se traduit par un blocage total de la sécrétion.

Rim1a ou Rim2a agissent dans le processus de liaison à la zone active par leur interaction avec Rab3A (arrimage, voir ci-dessous). La protéine Munc13, liée à la zone active par Rim1a/2a, joue un rôle primordial dans l'activation de la syntaxine–1A/B (située sur la membrane de la vésicule). Dans la figure 35 et la figure 36, qui illustrent les événements de formation et de fusion de vésicules de sécrétion, nous ne montrons qu'une sélection de ces protéines.

  

Muncs et uncs (Munc pour murine unc et unc pour uncoordinated)

Les gènes « unc » ont été mis en évidence dans des études de mutagenèse chez Caenorhabditis elegans (C. elegans), les mutants étaient affectés d'un déficit locomoteur profond. Dans le cas d'Unc18, il a été montré que le manque de coordination dans le mouvement était en relation avec une libération défectueuse de l'acétylcholine par les motoneurones.

Il existe toute une famille de protéines qui ressemblent à Sec1/Munc18 et que l'on nomme protéines SM, parmi lesquelles on trouve Munc18 et rSly1.

Pour la sécrétion contrôlée, on distingue deux étapes dans le processus de fusion : arrimage et fusion -dépendante.

1/ L'arrimage commence par la liaison entre Rab3A–GTP présent sur la vésicule, et Rim1a ou 2a, présent sur la zone active (voir figure 36). Il est suivi par le démantèlement des complexes cis-SNARE, par l'ATPase NSF (Sec18) associée à –SNAP (Sec17p), et la formation des complexes trans-SNARE, stabilisés par la complexine et par la synaptotagmine. L'ensemble se matérialise par la formation d'une protubérance de fusion, connue sous le nom de « fusion stalk ». Dans les synapses hippocampiques plus de 200 vésicules s'assemblent près de la membrane (à une distance de 2 um environ), 10 d'entre elles étant arrimées à la zone active (voir figure 37, et cliquez sur la loupe 1 pour plus de détail sur la fusion membranaire).

Figure 37. Libération synaptique d'acétylcholine

Figure 37. Libération synaptique d'acétylcholine
[Cliquez sur les loupes pour plus de détail...]

    Le processus décrit, et illustré dans la figure 37 ci-dessus, est proposé en animation par T. Galli et V. Haucke
 Macromedia Flash - 213Ko

2/ La fusion se réalise lorsque la concentration intracellulaire en libre passe de 0,15  à un minimum de 1  grâce à l'ouverture de canaux calciques de type–L (voltage dépendants ou L–VDCC). Pour une zone active, 20 canaux– environ s'ouvrent et le signal dure 4 à 5 msec. La vitesse avec laquelle il déclenche la libération de neurotransmetteurs (moins de 0,4 msec) suggère que le ne fait qu'ouvrir le pore sans intervenir dans le processus d'arrimage.

Synaptotagmine, et l'ouverture du pore

L'ouverture du pore coïncide avec une translocation des domaines C2A et C2B de la synaptotagmine, les deux domaines de liaison du , sur la membrane plasmique. La liaison de est partagée entre C2A et C2B et les têtes polaires de phosphatidyl–sérine (PS) du feuillet interne de la membrane présynaptique.

Après fusion, les vésicules sont « récupérées » de trois façons : 1/ « kiss-and-stay », le pore de fusion s'ouvre puis se ferme et la vésicule reste à la membrane, 2/ « kiss-and-run », le pore de fusion s'ouvre et se ferme, la vésicule se détache de la membrane puis s'arrime de nouveau (après avoir été éventuellement rechargée), et 3/ la vésicule est intégrée à la membrane et l'excès membranaire est récupéré sous forme d'une vésicule tapissée de clathrine, qui sera dirigée vers le réseau trans-golgien (cliquez sur la loupe-2 de la figure 37 pour plus de détail sur le recyclage de la vésicule synaptique).

  Partez en excursion : pore transitoire de fusion

  Partez en excursion : l'importance des différents composants dans le processus de la libération de neurotransmetteur

  

Pour en savoir plus, consultez les articles suivants : « SNARE complex synaps Brunger » (551 Ko), « exocytosis synapse Sudhof review » (1121 Ko), « Synapse, Galli » (131 Ko), « fusion pore ATPase Morel » (195 Ko).

  

Consultez le site web d'un laboratoire performant sur le sujet :
http://thierry.galli.free.fr

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Les voies d'endocytose

Les éléments extracellulaires à incorporer dans la cellule, sont inclus par invagination progressive de la membrane plasmique qui finit par s'étrangler, formant ainsi une vésicule intracytoplasmique ; dans son ensemble le processus est nommé endocytose et la vésicule, endosome. On distingue deux types principaux d'endocytose : la pinocytose, qui implique l'ingestion de liquide (de pino = boire) et la phagocytose qui implique l'ingestion de grosses particules (de phago = manger). Toutes les cellules ingèrent continuellement du liquide par pinocytose. De même, toutes les cellules phagocytent mais il existe cependant des cellules spécialisées dans cette activité ; les neutrophiles et les monocytes/macrophages. Dans le cas de la phagocytose, l'endosome est appelé, phagosome. Le phagosome, comme l'endosome, fusionne avec des lysosomes primaires et le matériel ingéré est dégradé (voir figure 38).

Figure 38. Les différents modes d'endocyose

Figure 38. Les différents modes d'endocyose

L'endocytose implique la capture spécifique de macromolécules (ligands) par des protéines de la membrane plasmique qui se comportent comme des récepteurs, un phénomène qualifié d'endocytose par récepteur interposé. Les ligands peuvent être des composants de la matrice extracellulaire, des hormones, des cytokines, les protéines porteuses de différentes sortes, mais aussi des bactéries et des virus. En même temps que le ligand, du liquide extracellulaire est incorporé d'une façon non discriminante.

Le processus endocytotique implique différents types de vésicules de 50 à 150 nm de diamètre, que l'on distingue selon leur aspect microscopique et leur composition moléculaire. La pinocytose est réalisée par des vésicules nues, des cavéoles ou des vésicules tapissées de clathrine et la phagocytose utilise des phagosomes. Les caractéristiques de ces différents modes (sauf vésicule nue) sont évoquées dans ce chapitre.

  

Pour en savoir plus, consultez le document suivant : « Endocytosis Mellman » (701 Ko).

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Les voies d'endocytose
Cavéoles

Ces petites vésicules de 50 nm de diamètre, en forme de flacon, sont présentes dans toutes les cellules animales et, dans les cellules endothéliales, elles peuvent représenter jusqu'à 10 de la surface totale. Elles sont revêtues d'une protéine transmembranaire de 22 kDa appelée cavéoline et elles sont riches en cholestérol et en sphingomyéline (voir figure 33A). L'association lipide–cavéoline constitue les radeaux lipidiques (structures connues pour leur résistance aux détergents) où sont concentrés les récepteurs spécifiques de certaines hormones et cytokines (voir figure 34).

Tableau 6 : protéines présentes dans les cavéoles

Constituant

Fonction

Lipides

 

Acide Arachidonique

Acide gras impliqué dans la signalisation par les prostaglandines, leukotriènes et anandamide (cannabinoïde endogène)

Sphingomyéline

?

Cholestérol

Composant lipidique de la membrane

Plasményléthanolamine

 

Cavéoline

Revêtement des cavéoles

Complexe glycoprotéique associé à la dystrophine

Spécifique de la cellule musculaire et associé à cavéoline–3

Récepteurs de facteurs de croissance et d'hormones

 

Récepteur de l'EGF

 

Récepteur de l'insuline

 

Récepteur du PDGF

 

Récepteur du NGF

 

Divers

 

Flotilline

?

Fyn

Tyrosine kinase cytoplasmique

Ras

Protéines G–monomériques

Enzymes liées au GPI

Plusieurs

Intégrines

Molécules d'adhérence

Striatine, SG2NA, Zinédine

Protéines d'échafaudage dépendantes du /calmoduline

PrP

Prion de l'ESB et de maladie Creutzfeldt–Jacob

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Les voies d'endocytose
Vésicules tapissées de clathrine

A propos du Golgi nous avons déjà évoqué la clathrine, protéine impliquée dans le bourgeonnement de vésicules issues du réseau trans-golgien et la récupération de protéines à partir des endosomes précoces ou tardifs. De plus, comme la cavéoline, la clathrine participe aussi à l'endocytose en formant des vésicules de 100 à 150 nm de diamètre. Les vésicules d'endocytose tapissées de clathrine sont présentes dans toutes les cellules et en particulier sont impliquées dans la capture : de lipoprotéines chargées en cholestérol, de ferritine chargée en fer, de récepteurs occupés par des cytokines ou des hormones. Enfin, l'excès de membrane consécutif à l'exocytose est résorbé par ces vésicules, évènement qui recycle également la machinerie de fusion.

Figure 39. Incorporation de LDL par une vésicule tapissée de clathrine

Figure 39. Incorporation de LDL par une vésicule tapissée de clathrine
[Cliquez sur la loupe pour plus de détail...]

L'endocytose clathrine-dépendante commence par le recrutement de complexes AP2 (adapter protein–2) sur la membrane plasmique (l'évènement qui déclenche le recrutement semble être la production locale de l'inositol–4,5–diposphate ou inositol–3,4,5–triphosphate). AP2 est composé de quatre sous-unités, deux grandes dénommées – et –adaptine (100 kDa), et deux petites, et (50 et 20 kDa respectivement). AP2 est le récepteur du complexe (jouant un rôle équivalent à Sec23 dans la formation de la vésicule COPII, ou équivalent à AP1A dans la formation du lysosome primaire) ; il interagit avec des peptides de destination porteurs du motif (dans lequel représente l'un des acides aminés hydrophobes). Exemples : le récepteur de la transferrine est lié à AP2 grâce à la séquence YTRF et le récepteur de l'EGF grâce à la séquence YKGL. Plusieurs récepteurs membranaires différents peuvent partager la même vésicule tapissée de clathrine (voir figure 39 et cliquez sur la loupe pour plus de détail sur AP2 et le récepteur de LDL fixant l'apolipoprotéine–A1 ( = apoprotéine–A1 + cholestérol/phospholipides)).

  

Le récepteur à la lipoprotéine de faible densité (LDL) est reconnu par AP2 grâce à la séquence FDNPVY–807, qui est un motif canonique (consensuel). Ce motif fut découvert chez des patients atteints d'hypercholestérolémie (niveau très élevé de cholestérol sanguin) car déficients dans la capture de LDL par suite d'une substitution de la tyrosine 807 du motif d'internalisation.

L'auto assemblage du manteau AP2 provoque un regroupement de protéines membranaires dans les « puits tapissés », phénomène connu sous le nom de « patching » ou « capping ». Les complexes AP2 assemblés fixent alors la clathrine, complexe protéique hexamérique composé de trois chaînes lourdes (190 kDa) et de trois chaînes légères (LCa ou LCb de 30 kDa). L'ensemble forme une structure à trois «jambes» qui lui a valu le nom de triskélion (du Grec skelos = jambe). Les triskélions s'auto assemblent en hexagones et pentagones (voir figure 40) et finissent par former une structure grillagée formant une cage sphérique. C'est là l'origine du mot clathrine = cage.

Figure 40. Les triskélions de clathrine

Figure 40. Les triskélions de clathrine

La fission qui s'ensuit nécessite l'intervention de la GTPase dynamine (protéine de 100 kDa), qui, en se liant au GTP, se polymérise pour former un col d'étranglement qui se resserre pour libérer la vésicule (un processus également dépendant de la présence d'inositol–4,5–disposphate). La dynamine recrute l'endophiline, phospholipase qui catalyse la production d'acide lysophosphatidique, qui autorise une courbure très forte de la membrane plasmique.

L'ensemble des évènements s'effectue en 60 secondes approximativement et on estime que, dans ce laps de temps, une cellule est capable de soustraire jusqu'à 40 de ses composants membranaires. Peu après son internalisation, la vésicule perd son manteau par l'intervention de Hsc70 (membre de la famille de chaperonnes « heat-shock »), d'auxiline et de synaptojanine (une phosphatidyl 5–kinase).

  

Pour en savoir plus, consultez les documents suivants : « clathrine coat formation Wakelam » (408 Ko), « AP2 clathrin minireview » (98 Ko).

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Les voies d'endocytose
Phagocytose

C'est une forme particulière d'endocytose par récepteur interposé qui concerne des particules et de grands complexes macromoléculaires (voir figure 41 et cliquez sur la loupe pour une image très détaillée). Deux récepteurs sont impliqués : l'un, FcR, qui fixe la fraction Fc des immunoglobulines (anticorps) et l'autre, CR1, qui fixe le C3b, composant de la cascade du complément. Par l'intermédiaire des immunoglobulines et/ou de C3b, les monocytes, macrophages et granulocytes peuvent adsorber les particules étrangères telles que des bactéries. Les très nombreuses immunoglobulines et/ou les C3b, fixés à la fois à la surface de la particule et aux récepteurs portés par le phagocyte, déclenchent un mouvement phagocytique par lequel la membrane plasmique englobe graduellement la particule étrangère. Ceci implique la formation de lamellipodes sous l'impulsion des filaments d'actine.

Figure 41. Phagocytose

Figure 41. Phagocytose
[Cliquez sur la loupe pour plus de détail...]

Une fois à l'intérieur de la cellule, le phagosome fusionne avec les lysosomes primaires qui permettront par leurs enzymes hydrolytiques de détruire la particule étrangère. Le processus est accompagné par la production d'espèces oxygénées réactives (radicaux libres d'oxygène tels que , acide hypochlorique et peroxyde d'hydrogène ) due à un complexe enzymatique, la NADPH : oxydoréductase. Ces espèces oxygénées se lient aux lipides et aux protéines, causant ainsi leur dénaturation (voir figure 41 et figure 42).

Lorsque les particules étrangères sont spécifiquement recouvertes d'immunoglobulines (phénomène d'opsonisation), leur ingestion et leur destruction sont beaucoup plus efficaces que lorsque le complément (C3b) seul s'y fixe. C'est une de raisons pour lesquelles la vaccination, qui augmente le taux d'immunoglobulines spécifiques, nous protège d'une infection bactérienne.

Figure 42. Levures phagocytées par des granulocytes

Figure 42. Levures phagocytées par des granulocytes

Remarque : cependant, même en l'absence d'immunoglubolines spécifiques, les bactéries sont reconnues comme étrangères car leur surface riche en lipopolysaccharides induit l'activation du complément et la fixation d'un de ses composants C3b (voie alternative d'activation du complément). C3b sera reconnu par CR1 (ou Mac–1), qui permettra au phagocyte d'enrober la bactérie.

  

Pour en savoir plus, consultez les documents suivants : « phagocytosis GTPases Niedergang » (244 Ko), « phagocytosis cytoskeleton Caron » (331 Ko).

  

Consultez le site web d'un laboratoire performant sur le sujet :
http://www.curie.fr/recherche/themes/detail_equipe.cfm/lang/_fr/id_equipe/22.htm

  Partez en excursion : Mechnikov et les phagocytes

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Les endosomes

 

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Les endosomes
Endosome précoce

Les endosomes (ou phagosomes) ainsi formés, sont acidifiés par une pompe à protons, ATPase type V, présente dans leur membrane. Le pH chute à 6,5 ce qui provoque la dissociation de la plupart des ligands endocytés encore fixés à leurs récepteurs. De multiples fusions surviennent entre les endosomes, aussi bien qu'avec les lysosomes primaires, créant un surplus de surface membranaire qui dans un deuxième temps sera utilisé pour : 1/ la récupération de protéines membranaires, pour les retourner après bourgeonnement de vésicules ou de tubules, vers la membrane plasmique ou le réseau transgolgien ; et 2/ la formation de vésicules par invagination vers l'intérieur de l'endosome (voir figure 44 et figure 45). La vésicule intra-endosomale ainsi formée sera probablement intégralement détruite, processus qui permet l'élimination du domaine cytoplasmique des récepteurs.

Figure 44. Devenir du contenu des vésicules d'endocytose ; l'endosome précoce

Figure 44. Devenir du contenu des vésicules d'endocytose ; l'endosome précoce

On estime que certains récepteurs (de la transferrine et des LDL, par exemple) peuvent effectuer 100 fois la navette entre membrane et endosome, se chargeant en ligand du coté membrane et se déchargeant dans l'endosome. Pour ce qui est des récepteurs des facteurs de croissance, le processus diffère : le ligand ne se dissocie pas en milieu acide, si bien que les récepteurs occupés sont tous détruits dans le lysosome. Seuls les récepteurs restés libres (probablement après internalisation accidentelle) sont recyclés vers la membrane plasmique. L'élimination de récepteurs occupés participe au phénomène dit de désensibilisation, au cours duquel une cellule devient insensible aux fortes concentrations de ligands.

La machinerie de fusion des endosomes précoces est composée de Q–SNARES, syntaxine 13 ou 16, vti1a , syntaxine–6 : le R–SNARE, Vamp4 ou Vamp8 (vesicle-associated membrane protein) ; de la GTPase Rab5 ; de l'effecteur EEA1 (early endosome antigen–1) et de la Vsp45 (yeast vacuolar sorting protein–45, une PI 3–kinase).

  

Pour en savoir plus, consultez le document suivant : « Erb signal internalisation Yarden » (2387 Ko).

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Les endosomes
Endosome tardif

Le pH est maintenant tombé à 5,0 et la teneur en hydrolases est très haute, consécutivement à l'apport continuel de lysosomes primaires. Les endosomes tardifs fusionnent aussi avec d'autres endosomes et le surplus membranaire qui en résulte est utilisé pour la formation de vésicules intra-endosomales, conduisant à des corps multivésiculaires (voir figure 45 et cliquez sur la loupe pour plus de détail). C'est le dernier état où la récupération des protéines à recycler est encore possible, après quoi l'endosome tardif « régresse » vers l'état d'un lysosome (secondaire) et puis d'un corps résiduel.

Figure 45. Devenir du continue des vésicules d'endocytose ; l'endosome tardif et le lysosome

Figure 45. Devenir du continue des vésicules d'endocytose ; l'endosome tardif et le lysosome
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La machinerie de fusion des endosomes tardifs est composée de Q–SNAREs, syntaxine–7, vti1b, syntaxine–8 ; de R–SNARE, Vamp8 (vesicle-associated membrane protein), la GTPase Rab7 ; de la protéine effectrice, EEA1 (early endosome antigen 1) et enfin de Vsp33a/b (yeast vacuolar sorting protein–33).

  

Pour en savoir plus, consultez le document suivant : « destination motifs transmembrane proteins for endosome and lysosome » (854 Ko).

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